Proteiini P16:n ilmentymisen immunohistokemiallinen arviointi munasarjan sukusolukasvaimissa.

Tässä tutkimuksessa pyrimme:

1 - Arvioi p16:n immunohistokemiallinen ilmentyminen hyvänlaatuisten ja pahanlaatuisten OGCT:iden neoplastisessa komponentissa ja pisteytä sen immunoreaktiivisuus.

2-Korreloi P16-immunohistokemiallisen ilmentymisen MOGCT:issä, joissa on Ki 67 -proliferaatioindeksi, ja FIGO-vaiheen välillä.

1. Tutkimuksen tyyppi: Vastaava tapaus-verrokkitutkimus.

2. Opiskeluaineet:

   1. Sisällytämiskriteerit: Erityyppiset munasarjan sukusolukasvaimet, mukaan lukien: hyvänlaatuiset (kystinen kystinen teratomi) ja pahanlaatuiset (dysgerminoma, epäkypsä teratomi ja keltapussikasvain).

   2. Poissulkemiskriteerit:

      Kaikki kriteerit, jotka eivät täytä sisällyttämiskriteerejä, kuten leikatut munasarjakasvaimet, muut kuin munasarjojen itusolukasvaimet, esim. epiteelin munasarjakasvaimet, sukupuolinuoran stroomakasvaimet tai metastaattiset munasarjavauriot.

      • Tutkimuspöytäkirjan hyväksyi Assiutin yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan Institutional Review Board joulukuussa 2019 (IRB nro 17100871) ja eettinen hyväksyntä tälle tutkimukselle saatiin Assiutin yliopiston lääketieteellisen tiedekunnan lääketieteellisen etiikan komitealta.
      • Opiskelupaikka: Assiut-yliopiston Lääketieteellisen tiedekunnan patologian laitoksen IHC-laboratorio.
      • Kudosnäytteenotto: Kuusikymmentäkaksi formaliinikiinnitettyä, parafiinivahaan upotettua munasarjanäytettä saatiin Assiutin yliopistollisen sairaalan (AUH) ja Etelä-Egyptin syöpäinstituutin (SECI) kirurgisen patologian osastoilta tammikuusta 2010 tammikuuhun 2021. Nämä näytteet sisältävät:

      (Ryhmä A) 22 pahanlaatuista munasarjan itusolukasvainta (MOGCT), (B-ryhmä) 20 näennäistä normaalia munasarjakudosta kontrolliryhmänä ja (ryhmä C) 20 kypsää kystistä teratomaa samanlaisena hyvänlaatuisena vertailuryhmänä.

      Ryhmä A sisältää 5 dysgerminoomaa, 8 epäkypsää teratomaa (neljä niistä Grade II ja muut neljä ovat Grade III, FIGO-luokitusjärjestelmä) ja 9 keltapussikasvainta. Potilaiden ikä oli 12-23 vuotta (mediaani-ikä 16,5 vuotta). Kunkin MOGCT:n alkuperäinen diagnoosi arvioitiin uudelleen WHO:n munasarjakasvainten luokituksen mukaisesti.

      Ryhmä B sisältää normaalisti näkyvät munasarjat, jotka leikattiin kirurgisesti näytteillä vatsan kokonaiskohdunpoistosta ja salpingo-oferktomiasta muiden kuin munasarjojen, ei-pahanlaatuisten syiden vuoksi, kuten moninkertaisena kohdun fibroidina ja adenomyoosina kontrolliryhmänä. Potilaiden ikä vaihteli välillä 42-64 vuotta (mediaani 50 vuotta).

      Kaikki saatavilla olevat hematoksyliinilla ja eosiinilla värjätyt objektilasit tutkivat kaksi riippumatonta patologia rutiinivalomikroskopialla ja edustavinta yhtä tai kahta kudoslohkoa käytettiin immunohistokemialliseen värjäykseen. Kliiniset ja patologiset tiedot sisältävät iän, asteen, vaiheen, leesioiden uusiutuminen arvioitiin patologisten raporttien mukaan.

      • Immunohistokemia: Kudosnäytteet olivat formaliinilla kiinnitettyjä, parafiiniin upotettuja kudoslohkoja ja niitä säilytettiin huoneenlämpötilassa. Valituista edustavista kudoslohkoista leikattiin ohuita 4 um:n paksuisia leikkeitä ja ne siirrettiin päällystetyille objektilaseille, pidettiin uunissa 70 °C:ssa 25 minuuttia, parafiini poistettiin pesemällä kahdessa ksyleenisäiliössä 15 minuutin ajan ja hydratoitiin uudelleen läpi. sarjalaimennoksia (100 %, 90 %, 80 %, 70 %) alkoholia 5 minuutin ajan jokaisessa laimennoksessa. Sitten leikkeitä käsiteltiin 3-prosenttisella vetyperoksidilla 10 minuuttia epäspesifisen taustan estämiseksi, mitä seurasi PBS-puskuripesu 4 kertaa riittävästi. Antigeenin hakemista varten objektilasit pidettiin sitraattipuskurissa (PH = 6) ja autoklavoitiin 90 °C:ssa 15 minuuttia ja jätettiin jäähtymään huoneenlämpötilaan. Objektilasit pestiin PBS-puskurilla 4 kertaa riittävästi ja kudosleikkeitä inkuboitiin primaarisen vasta-aineen kanssa; p16INK4a Rekombinantti kanin monoklonaalinen vasta-aine (RM267) (MA5-27905) laimennoksena 1:500 yön yli, mitä seuraa inkubaatio sekundaarisen vasta-aineen kanssa; Moniarvoinen polymeeri-HRP 10 minuuttia kutakin vaihetta kohti, mitä seurasi riittävä 4 kertaa PBS-puskuripesu. Kudoksia käsiteltiin sitten diaminobentsidiinikromogeenilla (DAP-kromogeeni) ruskean värin kehittämiseksi 10 minuutin ajan. Sitten leikkeitä käsiteltiin Mayer-hematoksyliinillä vastavärjäyksenä 2 minuutin ajan.

      Ainoastaan ​​pahanlaatuisista tapauksista saatuihin leikkeisiin lisäämme ylimääräisen Ki67 IHC -värjäyksen, koska kudosleikkeitä deparffinoinnin ja 3 % vetyperoksidaasilla eston jälkeen inkuboitiin primaarisen vasta-aineen kanssa; Ki67-vasta-aine (DAKO), valmis käytettäväksi 20 minuuttia, jota seuraa inkubaatio sekundaarisen vasta-aineen kanssa; Moniarvoinen polymeeri-HRP 20 minuuttia, jota seurasi käsittely diaminobentsidiinikromogeenilla (DAP-kromogeeni) ruskean värin kehittämiseksi 5 minuutin ajan. Sitten leikkeitä käsiteltiin Mayer-hematoksyliinillä vastavärjäyksenä 2 minuutin ajan.

      Objektilasit pestiin vesijohtovedellä, kuivattiin alkoholin sarjalaimennoksilla, pestiin ksyleenillä lyhyen aikaa ja kiinnitettiin DPX:llä.

      Normaalia näennäistä munasarjakudosta käytettiin kontrolleina. Positiivisina kontrolleina käytettiin leikkeitä kohdunkaulan keratinisoitumattomasta levyepiteelikarsinoomasta, jossa on estetty p16-ekspressio; ja kudoslevyt ilman primääristä vasta-ainekäsittelyä toimivat negatiivisina kontrolleina.

      -Immunohistokemiallinen arviointi: P16 IHC-värjäystä varten P16-positiivisten solujen prosenttiosuus ja positiivisten signaalien (nukleaaristen tai sytoplasmisten) sijainti arvioitiin visuaalisesti kaikkien leesioiden neoplastisten komponenttien osalta. P16:n ilmentymisen arvioimiseen käytettiin saksalaista semikvantitatiivista pisteytysjärjestelmää, koska jokaiselle kasvaimelle annetaan pistemäärä sytoplasmisen ja nukleiinivärjäytymisen intensiteetin mukaan (ei värjäytymistä = 0, heikko värjäytyminen = 1, kohtalainen värjäytyminen = 2, voimakas värjäytyminen = 3 ) Ja värjäytyneiden solujen määrä (0 % = 0, 1-10 % = 1, 11-50 % = 2, 51-80 % = 3, 81-100 % = 4). Lopullinen immunoreaktiivinen pistemäärä määritetään kertomalla intensiteettipisteet värjäytyneiden solujen positiivisuuspisteiden määrällä siten, että vähimmäispistemäärä on 0 ja maksimipistemäärä 12 (pisteet 0, 1,2,3,4,6,8, 9 ja 12).

      Vain pahanlaatuisten tapausten KI67 IHC-värjäykseen arvioitiin tumapositiivisuudella värjäytyneiden solujen prosenttiosuus riippumatta värjäytymisen intensiteetistä kaikissa tutkituissa osissa (vähintään 1000 kasvainsolua laskettiin per leikkaus KI-indeksin arvioimiseksi).

      -Tilastollinen analyysi: Tiedot analysoitiin IBM-SPSS-versiolla 24. Numeeriset tiedot esitettiin keskiarvona ja keskihajonnana, kun taas kategoriset tiedot lukuina ja prosentteina. Kuvaavat tilastot: Keskiarvot, keskihajonnat, mediaanit, vaihteluvälit ja prosentit laskettiin. Merkittävyyden testi: jatkuville muuttujille, joissa on enemmän kuin kaksi luokkaa; ANOVA-testi laskettiin testaamaan normaalijakaumaa seuraavien tietojen keskimääräisiä eroja ja riippumatonta näytettä Kruskal-Wallis käytettiin vertaamaan mediaanieroa ryhmien välillä, jotka eivät noudata normaalijakaumaa, post-hoc-testi laskettiin käyttämällä Bonferroni-korjauksia. Käytettiin korrelaatioanalyysiä (Spearman' Ranked correlation, 2-tailed).

      P-arvoa < 0,05 pidettiin merkitsevänä.