Avaliação Imuno-histoquímica da Expressão da Proteína P16 em Tumores de Células Germinativas de Ovário.

Neste estudo, pretendemos:

1-Avaliar a expressão imuno-histoquímica de p16 no componente neoplásico de OGCTs benignos e malignos e pontuar sua imunorreatividade.

2-Correlacionar a expressão imuno-histoquímica de P16 em MOGCTs com índice de proliferação Ki 67 e estadiamento FIGO.

1. Tipo de estudo: Estudo de caso-controle pareado.

2. Temas de estudo:

   1. Critérios de inclusão: Diferentes tipos de tumores ovarianos de células germinativas, incluindo: benignos (teratoma cístico maduro) e malignos (disgerminoma, teratoma imaturo e tumor do saco vitelino).

   2. Critério de exclusão:

      Quaisquer critérios que não preencham os critérios de inclusão, como tumores ovarianos ressecados, exceto tumores ovarianos de células germinativas, por exemplo, tumores ovarianos epiteliais, tumores estromais de cordão sexual ou lesões ovarianas metastáticas.

      • O protocolo do estudo foi aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Faculdade de Medicina da Universidade de Assiut em dezembro de 2019 (IRB nº 17100871) e a aprovação ética para este estudo foi obtida do comitê de ética médica da Faculdade de medicina da Universidade de Assiut.
      • Local de estudo: Laboratório de Patologia do IHC, Faculdade de Medicina, Universidade de Assiut.
      • Amostragem de tecido: Sessenta e duas amostras de ovário fixadas em formalina e embebidas em cera de parafina foram obtidas dos departamentos de patologia cirúrgica do Assiut University Hospital (AUH) e do South Egypt cancer Institute (SECI) de janeiro de 2010 a janeiro de 2021. Esses espécimes incluem:

      (Grupo A) 22 tumores ovarianos malignos de células germinativas (MOGCTs), (Grupo B) 20 tecidos ovarianos normais aparentes como grupo controle e (Grupo C) 20 teratomas císticos maduros como grupo de comparação benigno igual.

      O grupo A é constituído por 5 disgerminomas, 8 teratomas imaturos (quatro deles Grau II e os outros quatro Grau III, sistema de classificação FIGO) e 9 tumores do saco vitelino. A idade dos pacientes variou de 12 a 23 anos (idade média de 16,5 anos). O diagnóstico inicial de cada MOGCTs foi reavaliado de acordo com a Classificação de Tumores de Ovário da OMS.

      O Grupo B inclui ovários normalmente aparentes que foram ressecados cirurgicamente com espécimes de histerectomia abdominal total e salpingo-oferectomia para causas não ovarianas e não malignas como útero mioma múltiplo e adenomiose como grupo controle. A idade dos pacientes variou de 42 a 64 anos (mediana de 50 anos).

      Todas as lâminas coradas com hematoxilina e eosina disponíveis foram examinadas por dois patologistas independentes por microscopia de luz de rotina e um ou dois blocos de tecido mais representativos foram usados ​​para coloração imuno-histoquímica. Os dados clínicos e patológicos incluem idade, grau, estágio, recorrência das lesões foram avaliados de acordo com relatórios patológicos.

      • Imuno-histoquímica: As amostras de tecido foram fixadas em formalina, blocos de tecido embebidos em parafina e foram armazenadas à temperatura ambiente. Seções finas de 4 um de espessura foram cortadas de blocos de tecido representativos selecionados e foram levadas para lâminas revestidas, mantidas em estufa a 70°C por 25 minutos, desparafinizadas por lavagem em dois recipientes de xileno por 15 minutos cada e reidratadas através de diluições seriadas (100%, 90%, 80%, 70%) de álcool por 5 minutos em cada diluição. Em seguida, as seções foram tratadas com peróxido de hidrogênio a 3% por 10 minutos para evitar fundo inespecífico seguido de lavagem com tampão PBS 4 vezes adequadamente. Para recuperação antigênica, as lâminas foram mantidas em tampão citrato (PH = 6) e autoclavadas a 90°C por 15 minutos e deixadas resfriar à temperatura ambiente. As lâminas foram lavadas com tampão PBS 4 vezes adequadamente e os cortes de tecido foram incubados com anticorpo primário; p16INK4a Anticorpo Monoclonal Recombinante de Coelho (RM267) (MA5-27905) a uma diluição de 1:500 durante a noite, seguido de incubação com anticorpo secundário; Polímero polivalente-HRP por 10 minutos para cada etapa, seguido por 4 vezes adequadas de lavagem com tampão PBS. Os tecidos foram então tratados com cromogênio Diaminobenzidina (DAP-cromogênio) para o desenvolvimento da cor marrom por 10 minutos. Em seguida, os cortes foram tratados com hematoxilina de Mayer como contracoloração por 2 minutos.

      Para seções recebidas apenas de casos malignos, adicionamos coloração Ki67 IHC adicional como seções de tecido após desparafinização e bloqueio por 3% de peroxidase de hidrogênio foram incubadas com anticorpo primário; Anticorpo Ki67 (DAKO), pronto para uso por 20 minutos, seguido de incubação com anticorpo secundário; Polímero polivalente-HRP por 20 minutos, seguido de tratamento com cromogênio Diaminobenzidina (DAP-cromogênio) para desenvolvimento de cor marrom por 5 minutos. Em seguida, os cortes foram tratados com hematoxilina de Mayer como contracoloração por 2 minutos.

      As lâminas foram lavadas com água corrente, desidratadas em diluições seriadas de álcool, lavadas com xileno por um curto período e montadas com DPX.

      Os tecidos ovarianos aparentes normais foram usados ​​como controles. Seções de carcinoma espinocelular não queratinizado cervical com expressão de p16 em bloco foram usadas como controles positivos; e as lâminas de tecido sem o tratamento com anticorpo primário serviram como controles negativos.

      - Avaliação imuno-histoquímica: Para a coloração P16 IHC, a porcentagem de células P16 positivas e a localização dos sinais positivos (nuclear ou citoplasmático) foram visualmente estimadas para componentes neoplásicos de todas as lesões. O sistema de pontuação semiquantitativo alemão foi usado para avaliar a expressão de P16, pois cada tumor receberá uma pontuação de acordo com a intensidade da coloração citoplasmática e nucleica (sem coloração = 0, coloração fraca = 1, coloração moderada = 2, coloração forte = 3 ) E a extensão das células coradas (0% = 0, 1-10% = 1, 11-50% = 2, 51-80% = 3, 81-100% = 4). O escore imunorreativo final será determinado pela multiplicação dos escores de intensidade com a extensão dos escores de positividade das células coradas, sendo o escore mínimo de 0 e o máximo de 12 (escore 0, 1,2,3,4,6,8, 9 e 12).

      Para a coloração KI67 IHC apenas para casos malignos, a porcentagem de células coradas com positividade nuclear foi avaliada, independentemente da intensidade da coloração em todas as seções examinadas (pelo menos 1.000 células tumorais foram contadas por seção para estimativa do índice KI).

      -Análise estatística: Os dados foram analisados ​​usando o IBM-SPSS versão 24. Os dados numéricos foram apresentados como média e desvio padrão, enquanto os dados categóricos foram apresentados como número e porcentagem. Estatística descritiva: Médias, desvios padrão, medianas, intervalos e porcentagens foram calculados. Teste de significância: para variáveis ​​contínuas com mais de duas categorias; O teste ANOVA foi calculado para testar as diferenças médias dos dados que seguem distribuição normal e amostra independente Kruskal-Wallis foi usado para comparar a diferença mediana entre os grupos que não seguem distribuição normal, o teste post-hoc foi calculado usando as correções de Bonferroni. A análise de correlação foi usada (correlação classificada de Spearman, 2-tailed).

      Um valor de p < 0,05 foi considerado significativo.