Immunhistochemische Bewertung der Protein P16-Expression in Keimzelltumoren der Eierstöcke.

In dieser Studie wollen wir :

1-Bewertung der immunhistochemischen Expression von p16 in neoplastischen Komponenten gutartiger und bösartiger OGCTs und Bewertung seiner Immunreaktivität.

2 – Korrelation zwischen der immunhistochemischen P16-Expression in MOGCTs mit Ki 67-Proliferationsindex und FIGO-Staging.

1. Art der Studie: Matched Case-Control Study.

2. Studienfächer:

   1. Einschlusskriterien: Verschiedene Arten von ovariellen Keimzelltumoren, darunter: gutartige (reifes zystisches Teratom) und bösartige (Dysgerminom, unreifes Teratom und Dottersacktumor).

   2. Ausschlusskriterien:

      Alle Kriterien, die die Einschlusskriterien nicht erfüllen, wie z. B. resezierte Ovarialtumoren, die keine Ovarialkeimzelltumoren sind, z. B. epitheliale Ovarialtumoren, Keimstrangtumoren oder metastasierende Ovarialläsionen.

      • Das Studienprotokoll wurde im Dezember 2019 vom Institutional Review Board der medizinischen Fakultät der Universität Assiut genehmigt (IRB Nr. 17100871) und die ethische Genehmigung für diese Studie wurde vom Ausschuss für medizinische Ethik der medizinischen Fakultät der Universität Assiut eingeholt.
      • Studienumgebung: IHC-Labor der Abteilung für Pathologie, Medizinische Fakultät, Universität Assiut.
      • Gewebeentnahme: Von Januar 2010 bis Januar 2021 wurden 62 formalinfixierte, in Paraffinwachs eingebettete Ovarialproben aus den Abteilungen für chirurgische Pathologie des Assiut University Hospital (AUH) und des South Egypt Cancer Institute (SECI) entnommen. Zu diesen Exemplaren gehören:

      (Gruppe A) 22 bösartige Keimzelltumoren der Eierstöcke (MOGCTs), (Gruppe B) 20 anscheinend normales Eierstockgewebe als Kontrollgruppe und (Gruppe C) 20 reife zystische Teratome als gleich gutartige Vergleichsgruppe.

      Gruppe A besteht aus 5 Dysgerminomen, 8 unreifen Teratomen (vier davon vom Grad II und die anderen vier vom Grad III, FIGO-Einstufungssystem) und 9 Dottersacktumoren. Die Patienten waren zwischen 12 und 23 Jahre alt (Durchschnittsalter 16,5 Jahre). Die Erstdiagnose jedes MOGCTs wurde gemäß der WHO-Klassifikation von Ovarialtumoren neu bewertet.

      Gruppe B umfasst normal sichtbare Eierstöcke, die chirurgisch reseziert wurden, mit Proben von totaler abdominaler Hysterektomie und Salpingo-Opherktomie aus nicht ovarialen, nicht bösartigen Ursachen wie multiplem Uterusfibrom und Adenomyose als Kontrollgruppe. Die Patienten waren zwischen 42 und 64 Jahre alt (Median 50 Jahre).

      Alle verfügbaren Hämatoxylin- und Eosin-gefärbten Objektträger wurden von zwei unabhängigen Pathologen durch routinemäßige Lichtmikroskopie untersucht, und die repräsentativsten ein oder zwei Gewebeblöcke wurden für die immunhistochemische Färbung verwendet. Die klinischen und pathologischen Daten, einschließlich Alter, Grad, Stadium, Wiederauftreten von Läsionen, wurden gemäß pathologischen Berichten ausgewertet.

      • Immunhistochemie: Die Gewebeproben waren Formalin-fixierte, Paraffin-eingebettete Gewebeblöcke und wurden bei Raumtemperatur gelagert. Dünne Schnitte mit einer Dicke von 4 um wurden aus ausgewählten repräsentativen Gewebeblöcken geschnitten und auf beschichtete Objektträger genommen, 25 Minuten lang in einem Ofen bei 70°C gehalten, durch jeweils 15-minütiges Waschen in zwei Behältern mit Xylol entparaffiniert und durch rehydriert Reihenverdünnungen (100 %, 90 %, 80 %, 70 %) Alkohol für 5 Minuten in jeder Verdünnung. Dann wurden die Schnitte 10 Minuten lang mit 3%igem Wasserstoffperoxid behandelt, um einen unspezifischen Hintergrund zu verhindern, gefolgt von einer angemessenen 4-maligen Waschung mit PBS-Puffer. Zur Antigengewinnung wurden die Objektträger in Citratpuffer (pH = 6) gehalten und bei 90°C für 15 Minuten autoklaviert und auf Raumtemperatur abkühlen gelassen. Die Objektträger wurden viermal ausreichend mit PBS-Puffer gewaschen und die Gewebeschnitte wurden mit primärem Antikörper inkubiert; p16INK4a rekombinanter monoklonaler Kaninchen-Antikörper (RM267) (MA5-27905) in einer Verdünnung von 1:500 über Nacht, gefolgt von Inkubation mit sekundärem Antikörper; Polyvalentes Polymer-HRP für 10 Minuten für jeden Schritt, gefolgt von angemessener 4-maliger Waschung mit PBS-Puffer. Die Gewebe wurden dann für 10 Minuten mit Diaminobenzidin-Chromogen (DAP-Chromogen) zur Entwicklung einer braunen Farbe behandelt. Dann wurden die Schnitte 2 Minuten lang mit Mayer-Hämatoxylin als Gegenfärbung behandelt.

      Für Schnitte, die nur von bösartigen Fällen stammen, fügen wir zusätzliche Ki67-IHC-Färbung hinzu, da Gewebeschnitte nach der Entparaffinierung und Blockierung durch 3 % Wasserstoffperoxidase mit primärem Antikörper inkubiert wurden; Ki67-Antikörper (DAKO), gebrauchsfertig für 20 Minuten, gefolgt von Inkubation mit sekundärem Antikörper; Polyvalentes Polymer-HRP für 20 Minuten, gefolgt von einer Behandlung mit Diaminobenzidin-Chromogen (DAP-Chromogen) für eine braune Farbentwicklung für 5 Minuten. Dann wurden die Schnitte 2 Minuten lang mit Mayer-Hämatoxylin als Gegenfärbung behandelt.

      Die Objektträger wurden mit Leitungswasser gewaschen, durch Reihenverdünnungen von Alkohol dehydriert, kurz mit Xylol gewaschen und mit DPX fixiert.

      Als Kontrollen wurden die normalen sichtbaren Eierstockgewebe verwendet. Schnitte von zervikalem, nicht keratinisiertem Plattenepithelkarzinom mit Block-p16-Expression wurden als positive Kontrollen verwendet; und die Gewebeschnitte ohne die primäre Antikörperbehandlung dienten als negative Kontrollen.

      - Immunohistochemische Bewertung: Für die P16-IHC-Färbung wurden der Prozentsatz an P16-positiven Zellen und die Position positiver Signale (nuklear oder zytoplasmatisch) für neoplastische Komponenten aller Läsionen visuell abgeschätzt. Das deutsche halbquantitative Bewertungssystem wurde verwendet, um die P16-Expression zu bewerten, da jedem Tumor eine Bewertung gemäß der Intensität der Zytoplasma- und Nukleinfärbung gegeben wird (keine Färbung = 0, schwache Färbung = 1, mäßige Färbung = 2, starke Färbung = 3 ) Und das Ausmaß der gefärbten Zellen (0 % = 0, 1–10 % = 1, 11–50 % = 2, 51–80 % = 3, 81–100 % = 4). Der endgültige immunreaktive Score wird durch Multiplizieren der Intensitätsscores mit dem Ausmaß der Positivitätsscores der gefärbten Zellen bestimmt, wobei der Mindestscore 0 und der Höchstscore 12 beträgt (Score 0, 1,2,3,4,6,8, 9 und 12).

      Für die KI67-IHC-Färbung nur für maligne Fälle wurde der Prozentsatz der nukleär positiv gefärbten Zellen unabhängig von der Intensität der Färbung in allen untersuchten Schnitten bewertet (mindestens 1000 Tumorzellen wurden pro Schnitt zur Schätzung des KI-Index gezählt).

      -Statistische Analyse: Die Daten wurden mit IBM-SPSS Version 24 analysiert. Numerische Daten wurden als Mittelwert und Standardabweichung dargestellt, während kategoriale Daten als Zahl und Prozentsatz dargestellt wurden. Deskriptive Statistik: Mittelwerte, Standardabweichungen, Mediane, Bereiche und Prozentsätze wurden berechnet. Signifikanztest: für stetige Variablen mit mehr als zwei Kategorien; Der ANOVA-Test wurde berechnet, um die mittleren Unterschiede der Daten zu testen, die der Normalverteilung folgen, und die unabhängige Stichprobe Kruskal-Wallis wurde verwendet, um die Mediandifferenz zwischen Gruppen zu vergleichen, die nicht der Normalverteilung folgen. Der Post-hoc-Test wurde unter Verwendung von Bonferroni-Korrekturen berechnet. Es wurde eine Korrelationsanalyse verwendet (Spearman'-Ranked-Korrelation, zweiseitig).

      Ein p-Wert < 0,05 wurde als signifikant angesehen.