Evaluación inmunohistoquímica de la expresión de la proteína P16 en tumores de células germinales de ovario.

En este estudio, nuestro objetivo es:

1-Evaluar la expresión inmunohistoquímica de p16 en componente neoplásico de OGCT benignos y malignos y puntuar su inmunorreactividad.

2-Correlacionar la expresión inmunohistoquímica de P16 en MOGCT con el índice de proliferación Ki 67 y la estadificación FIGO.

1. Tipo de estudio: Estudio de casos y controles emparejados.

2. Materias de estudio:

   1. Criterios de inclusión: Diferentes tipos de tumores de células germinales de ovario, incluidos: benignos (teratoma quístico maduro) y malignos (disgerminoma, teratoma inmaduro y tumor del saco vitelino).

   2. Criterio de exclusión:

      Cualquier criterio que no cumpla con los criterios de inclusión, como tumores de ovario resecados que no sean tumores de células germinales de ovario, por ejemplo, tumores epiteliales de ovario, tumores del estroma de los cordones sexuales o lesiones ováricas metastásicas.

      • El protocolo de estudio fue aprobado por la Junta de Revisión Institucional de la Facultad de Medicina de la Universidad de Assiut en diciembre de 2019 (IRB No.17100871) y la aprobación ética para este estudio se obtuvo del comité de ética médica de la Facultad de Medicina de la Universidad de Assiut.
      • Lugar de estudio: Laboratorio IHC del departamento de Patología, Facultad de medicina, Universidad de Assiut.
      • Muestreo de tejido: Se obtuvieron sesenta y dos muestras de ovario incluidas en cera de parafina y fijadas en formalina de los departamentos de patología quirúrgica del Hospital Universitario de Assiut (AUH) y el Instituto del Cáncer del Sur de Egipto (SECI) desde enero de 2010 hasta enero de 2021. Estos especímenes incluyen:

      (Grupo A) 22 tumores malignos de células germinales de ovario (MOGCT), (Grupo B) 20 tejido ovárico aparentemente normal como grupo de control y (Grupo C) 20 teratomas quísticos maduros como grupo de comparación benigno equivalente.

      El grupo A está formado por 5 disgerminomas, 8 teratomas inmaduros (cuatro de ellos de grado II y los otros cuatro de grado III, clasificación FIGO) y 9 tumores del saco vitelino. Los pacientes tenían edades comprendidas entre 12 y 23 años (mediana de edad 16,5 años). El diagnóstico inicial de cada MOGCT fue reevaluado de acuerdo con la Clasificación de Tumores de Ovario de la OMS.

      El grupo B incluye ovarios normalmente aparentes que se extirparon quirúrgicamente con especímenes de histerectomía abdominal total y salpingooferectomía por causas no ováricas ni malignas como útero con fibroma múltiple y adenomiosis como grupo de control. Los pacientes tenían edades comprendidas entre 42 y 64 años (mediana de 50 años).

      Todos los portaobjetos teñidos con hematoxilina y eosina disponibles fueron examinados por dos patólogos independientes mediante microscopía óptica de rutina y se usaron uno o dos bloques de tejido más representativos para la tinción inmunohistoquímica. Los datos clínicos y patológicos incluyen edad, grado, estadio, recurrencia de lesiones fueron evaluados según informes patológicos.

      • Inmunohistoquímica: Las muestras de tejido fueron bloques de tejido embebidos en parafina y fijados con formalina, y se almacenaron a temperatura ambiente. Se cortaron secciones delgadas de 4 um de espesor de bloques de tejido representativos seleccionados y se colocaron en portaobjetos recubiertos, se mantuvieron en un horno a 70 °C durante 25 minutos, se desparafinizaron mediante lavado en dos recipientes de xileno durante 15 minutos para cada uno y se rehidrataron a través de diluciones seriadas (100%, 90%, 80%, 70%) de alcohol durante 5 minutos en cada dilución. Luego, las secciones se trataron con peróxido de hidrógeno al 3% durante 10 minutos para evitar un fondo no específico, seguido de un lavado con tampón PBS 4 veces de manera adecuada. Para la recuperación del antígeno, los portaobjetos se mantuvieron en tampón de citrato (PH = 6) y se esterilizaron en autoclave a 90 °C durante 15 minutos y se dejaron enfriar a temperatura ambiente. Los portaobjetos se lavaron con tampón PBS 4 veces adecuadamente y las secciones de tejido se incubaron con anticuerpo primario; p16INK4a anticuerpo monoclonal de conejo recombinante (RM267) (MA5-27905) a una dilución de 1:500 durante la noche, seguido de incubación con anticuerpo secundario; Polímero polivalente-HRP durante 10 minutos para cada paso seguido de 4 veces adecuadas de lavado con tampón PBS. A continuación, los tejidos se trataron con cromógeno de diaminobencidina (cromógeno DAP) para el desarrollo de color marrón durante 10 minutos. Luego, las secciones se trataron con hematoxilina Mayer como tinción de contraste durante 2 minutos.

      Para las secciones recibidas solo de casos malignos, agregamos tinción Ki67 IHC adicional a medida que las secciones de tejido después de la desparfinación y el bloqueo con peroxidasa de hidrógeno al 3% se incubaron con el anticuerpo primario; Anticuerpo Ki67 (DAKO), listo para usar durante 20 minutos, seguido de incubación con anticuerpo secundario; Polímero polivalente-HRP durante 20 minutos, seguido de tratamiento con cromógeno de diaminobencidina (DAP-cromógeno) para el desarrollo de color marrón durante 5 minutos. Luego, las secciones se trataron con hematoxilina Mayer como tinción de contraste durante 2 minutos.

      Los portaobjetos se lavaron con agua del grifo, se deshidrataron mediante diluciones seriadas de alcohol, se lavaron con xileno durante un período breve y se montaron con DPX.

      Los tejidos ováricos aparentes normales se usaron como controles. Se utilizaron como controles positivos cortes de carcinoma de células escamosas no queratinizado de cuello uterino con expresión de bloqueo de p16; y los portaobjetos de tejido sin el tratamiento con anticuerpos primarios sirvieron como controles negativos.

      -Evaluación inmunohistoquímica: para la tinción IHC de P16, se estimó visualmente el porcentaje de células positivas para P16 y la ubicación de las señales positivas (nucleares o citoplasmáticas) para los componentes neoplásicos de todas las lesiones. Se utilizó el sistema alemán de puntuación semicuantitativa para evaluar la expresión de P16, ya que a cada tumor se le dará una puntuación de acuerdo con la intensidad de la tinción citoplásmica y nucleica (sin tinción = 0, tinción débil = 1, tinción moderada = 2, tinción fuerte = 3 ) Y la extensión de las células teñidas (0 % = 0, 1-10 % = 1, 11-50 % = 2, 51-80 % = 3, 81-100 % = 4). La puntuación inmunorreactiva final se determinará multiplicando las puntuaciones de intensidad por la extensión de las puntuaciones de positividad de las células teñidas, con una puntuación mínima de 0 y una puntuación máxima de 12 (puntuación 0, 1,2,3,4,6,8, 9 y 12).

      Para la tinción KI67 IHC solo para casos malignos, se evaluó el porcentaje de células teñidas con positividad nuclear, independientemente de la intensidad de la tinción en todas las secciones examinadas (se contaron al menos 1000 células tumorales por sección para estimar el índice KI).

      -Análisis estadístico: Los datos se analizaron utilizando IBM-SPSS versión 24. Los datos numéricos se presentaron como media y desviación estándar, mientras que los datos categóricos se presentaron como número y porcentaje. Estadísticas descriptivas: se calcularon medias, desviaciones estándar, medianas, rangos y porcentajes. Prueba de significancias: para variables continuas con más de dos categorías; Se calculó la prueba ANOVA para probar las diferencias de medias de los datos que siguen una distribución normal y se usó una muestra independiente de Kruskal-Wallis para comparar la diferencia de medianas entre los grupos que no siguen una distribución normal, la prueba post-hoc se calculó usando las correcciones de Bonferroni. Se utilizó el análisis de correlación (correlación clasificada de Spearman, 2 colas).

      Se consideró significativo un valor de p < 0,05.