Immunohistochemische evaluatie van proteïne P16-expressie in ovariumkiemceltumoren.

In deze studie streven we naar:

1-Evalueer de immunohistochemische expressie van p16 in neoplastische component van goedaardige en kwaadaardige OGCT's en scoor de immunoreactiviteit ervan.

2-correleren tussen immunohistochemische expressie van P16 in MOGCT's met Ki 67 prolifererende index en FIGO-enscenering.

1. Type studie: gematchte case-control studie.

2. Studie onderwerpen:

   1. Inclusiecriteria: Verschillende soorten ovariumkiemceltumoren, waaronder: goedaardige (volgroeide cystische teratoom) en kwaadaardige (dysgerminoom, onrijpe teratoom en dooierzaktumor).

   2. Uitsluitingscriteria:

      Alle criteria die niet aan de inclusiecriteria voldoen, zoals gereseceerde ovariumtumoren anders dan ovariumkiemceltumoren, bijv. epitheliale ovariumtumoren, geslachtskoord-stromale tumoren of metastatische ovariumlaesies.

      • Het studieprotocol werd in december 2019 goedgekeurd door de Institutional Review Board van de Faculteit der Geneeskunde, Universiteit van Assiut (IRB nr. 17100871) en de ethische goedkeuring voor deze studie werd verkregen van de commissie voor medische ethiek, Faculteit der geneeskunde, Universiteit van Assiut.
      • Studieomgeving: IHC-laboratorium van de afdeling Pathologie, Faculteit der Geneeskunde, Universiteit van Assiut.
      • Weefselbemonstering: Tweeënzestig met formaline gefixeerde, in paraffinewas ingebedde eierstokspecimens werden verkregen van afdelingen chirurgische pathologie in het Assiut University Hospital (AUH) en het Zuid-Egypte kankerinstituut (SECI) van januari 2010 tot januari 2021. Deze exemplaren omvatten:

      (Groep A) 22 kwaadaardige ovariumkiemceltumoren (MOGCT's), (Groep B) 20 ogenschijnlijk normaal ovariumweefsel als controlegroep en (Groep C) 20 volwassen cystische teratomen als gelijke goedaardige vergelijkingsgroep.

      Groep A bestaat uit 5 dysgerminomen, 8 onrijpe teratomen (vier van graad II en de andere vier zijn graad III, FIGO-beoordelingssysteem) en 9 dooierzaktumoren. De patiënten varieerden in leeftijd van 12 tot 23 jaar (mediane leeftijd 16,5 jaar). De initiële diagnose van elke MOGCT werd opnieuw geëvalueerd volgens de WHO-classificatie van ovariumtumoren.

      Groep B omvat normaal zichtbare eierstokken die chirurgisch zijn gereseceerd met monsters van totale abdominale hysterectomie en salpingo-oferctomie voor niet-ovariële, niet-kwaadaardige oorzaken als baarmoeder met meerdere vleesbomen en adenomyose als controlegroep. De patiënten varieerden in leeftijd van 42 tot 64 jaar (mediaan 50 jaar).

      Alle beschikbare hematoxyline- en eosine-gekleurde objectglaasjes werden onderzocht door twee onafhankelijke pathologen door middel van routinematige lichtmicroscopie en de meest representatieve een of twee weefselblokken werden gebruikt voor immunohistochemische kleuring. De klinische en pathologische gegevens omvatten leeftijd, graad, stadium, herhaling van laesies werden geëvalueerd volgens pathologische rapporten.

      • Immunohistochemie: de weefselmonsters waren met formaline gefixeerde, in paraffine ingebedde weefselblokken en werden bij kamertemperatuur bewaard. Dunne secties met een dikte van 4 um werden uit geselecteerde representatieve weefselblokken gesneden en op gecoate objectglaasjes gebracht, gedurende 25 minuten in een oven bij 70°C gehouden, van paraffine ontdaan door wassen in twee containers met xyleen gedurende 15 minuten voor elk en opnieuw gehydrateerd door seriële verdunningen (100%, 90%, 80%, 70%) alcohol gedurende 5 minuten in elke verdunning. Vervolgens werden secties gedurende 10 minuten behandeld met 3% waterstofperoxide om niet-specifieke achtergrond te voorkomen, gevolgd door 4 keer adequaat wassen met PBS-buffer. Om antigeen terug te winnen, werden de objectglaasjes in citraatbuffer (PH = 6) bewaard en gedurende 15 minuten bij 90°C in een autoclaaf behandeld, waarna men ze liet afkoelen tot kamertemperatuur. De objectglaasjes werden 4 keer adequaat gewassen met PBS-buffer en de weefselcoupes werden geïncubeerd met primair antilichaam; p16INK4a Recombinant monoklonaal konijnenantilichaam (RM267) (MA5-27905) bij een verdunning van 1:500 overnacht, gevolgd door incubatie met secundair antilichaam; Polyvalent polymeer-HRP gedurende 10 minuten voor elke stap, gevolgd door 4 keer voldoende PBS-bufferwassing. De weefsels werden vervolgens gedurende 10 minuten behandeld met diaminobenzidine-chromogeen (DAP-chromogeen) voor bruine kleurontwikkeling. Vervolgens werden secties gedurende 2 minuten behandeld met Mayer hematoxyline als de tegenkleuring.

      Alleen voor secties die zijn ontvangen van kwaadaardige gevallen, voegen we extra Ki67 IHC-kleuring toe, aangezien weefselsecties na deparffinisatie en blokkering door 3% waterstofperoxidase werden geïncubeerd met primair antilichaam; Ki67-antilichaam (DAKO), klaar voor gebruik gedurende 20 minuten, gevolgd door incubatie met secundair antilichaam; Polyvalent polymeer-HRP gedurende 20 minuten, gevolgd door behandeling met Diaminobenzidine chromogen (DAP-chromogen) voor bruine kleurontwikkeling gedurende 5 minuten. Vervolgens werden secties gedurende 2 minuten behandeld met Mayer hematoxyline als de tegenkleuring.

      De glaasjes werden gewassen met leidingwater, gedehydrateerd door seriële verdunningen van alcohol, gewassen met xyleen gedurende een korte periode en gemonteerd met DPX.

      De normale ogenschijnlijke eierstokweefsels werden als controles gebruikt. Secties van cervicaal niet-verhoornd plaveiselcelcarcinoom met blok p16-expressie werden gebruikt als positieve controles; en de weefselglaasjes zonder de primaire antilichaambehandeling dienden als de negatieve controles.

      - Immunohistochemische evaluatie: voor P16 IHC-kleuring werden het percentage P16-positieve cellen en de locatie van positieve signalen (nucleair of cytoplasmatisch) visueel geschat voor neoplastische componenten van alle laesies. Duits semi-kwantitatief scoresysteem werd gebruikt om de P16-expressie te evalueren, aangezien elke tumor een score krijgt volgens de intensiteit van de cytoplasmatische en nucleïnezuurkleuring (geen kleuring = 0, zwakke kleuring = 1, matige kleuring = 2, sterke kleuring = 3 ) En de mate van gekleurde cellen (0% = 0, 1-10% = 1, 11-50% =2, 51-80% = 3, 81-100% = 4). De uiteindelijke immunoreactieve score wordt bepaald door de intensiteitsscores te vermenigvuldigen met de mate van positiviteitsscores van gekleurde cellen, met een minimale score van 0 en een maximale score van 12 (score 0, 1,2,3,4,6,8, 9 en 12).

      Voor KI67 IHC-kleuring alleen voor kwaadaardige gevallen, werd het percentage van de met nucleaire positiviteit gekleurde cellen beoordeeld, ongeacht de intensiteit van de kleuring in alle onderzochte secties (ten minste 1000 tumorcellen werden per sectie geteld voor schatting van de KI-index).

      -Statistische analyse: gegevens zijn geanalyseerd met behulp van IBM-SPSS versie 24. Numerieke gegevens werden gepresenteerd als gemiddelde en standaarddeviatie, terwijl categorische gegevens werden gepresenteerd als aantal en percentage. Beschrijvende statistieken: gemiddelden, standaarddeviaties, medianen, bereiken en percentages werden berekend. Significantietoets: voor continue variabelen met meer dan twee categorieën; De ANOVA-test werd berekend om de gemiddelde verschillen te testen van de gegevens die de normale verdeling volgen en de onafhankelijke steekproef Kruskal-Wallis werd gebruikt om het mediane verschil te vergelijken tussen groepen die de normale verdeling niet volgen, de post-hoc-test werd berekend met behulp van Bonferroni-correcties. Correlatieanalyse werd gebruikt (Spearman' Geclassificeerde correlatie, tweezijdig).

      Een p-waarde < 0,05 werd als significant beschouwd.