Immunhistokemisk utvärdering av protein P16-uttryck i äggstockstumörer.

I denna studie strävar vi efter att:

1-Utvärdera det immunhistokemiska uttrycket av p16 i neoplastisk komponent av benigna och maligna OGCTs och poängsätt dess immunreaktivitet.

2-Korrelera mellan P16 immunhistokemiskt uttryck i MOGCTs med Ki 67 prolifererande index och FIGO stadieindelning.

1. Typ av studie: Matchad fall-kontrollstudie.

2. Studieämnen:

   1. Inklusionskriterier: Olika typer av äggstockstumörer, inklusive: benigna (mogna cystiska teratom) och maligna sådana (dysgerminom, omogna teratom och gulesäckstumör).

   2. Exklusions kriterier:

      Alla kriterier som inte uppfyller inklusionskriterierna, såsom resekerade äggstockstumörer andra än äggstockstumörer, t.ex. epitelial ovarialtumörer, könssträng-stromala tumörer eller metastaserande äggstocksskador.

      • Studieprotokollet godkändes av Institutional Review Board vid medicinska fakulteten, Assiut University i december 2019 (IRB nr.17100871) och etiskt godkännande för denna studie erhölls från kommittén för medicinsk etik, Medicinska fakulteten, Assiut University.
      • Studiemiljö: IHC-labbet vid Patologiavdelningen, Medicinska fakulteten, Assiut University.
      • Vävnadsprovtagning: Sextiotvå formalinfixerade, paraffinvaxinbäddade äggstocksprover erhölls från avdelningar för kirurgisk patologi vid Assiut University Hospital (AUH) och South Egypt cancer Institute (SECI) från januari 2010 till januari 2021. Dessa exemplar inkluderar:

      (Grupp A) 22 maligna äggstockstumörer (MOGCTs), (Grupp B) 20 skenbar normal äggstocksvävnad som kontrollgrupp och (Grupp C) 20 mogna cystiska teratom som lika godartad jämförelsegrupp.

      Grupp A utgör 5 dysgerminom, 8 omogna teratom (fyra av dem grad II och de andra fyra är grad III, FIGO-graderingssystem) och 9 gulesäckstumörer. Patienterna varierade i ålder från 12 till 23 år (medianåldern 16,5 år). Den initiala diagnosen av varje MOGCT omvärderades enligt WHO:s klassificering av äggstockstumörer.

      Grupp B inkluderar normalt uppenbara äggstockar som kirurgiskt resekeras med prover av total abdominal hysterektomi och salpingo-oferktomi för icke-ovarie, icke-maligna orsaker som multipel fibroid uterus och adenomyos som kontrollgrupp. Patienterna varierade i ålder från 42 till 64 år (median 50 år).

      Alla tillgängliga hematoxylin- och eosinfärgade objektglas undersöktes av två oberoende patologer med rutinljusmikroskopi och de mest representativa en eller två vävnadsblocken användes för immunhistokemisk färgning. De kliniska och patologiska data inkluderar ålder, grad, stadium, återfall av lesioner utvärderades enligt patologiska rapporter.

      • Immunhistokemi: Vävnadsproverna var formalinfixerade, paraffininbäddade vävnadsblock och förvarades vid rumstemperatur. Tunna sektioner med 4 um tjocklek skars ut från utvalda representativa vävnadsblock och överfördes till belagda objektglas, hölls i en ugn vid 70°C i 25 minuter, avparaffinerades genom tvättning i två behållare med xylen i 15 minuter för vardera och rehydrerades genom serieutspädningar (100 % , 90 % , 80 % , 70 %) alkohol i 5 minuter i varje spädning. Därefter behandlades sektioner med 3% väteperoxid i 10 minuter för att förhindra ospecifik bakgrund följt av PBS-bufferttvätt 4 gånger tillräckligt. För antigenåtervinning hölls objektglasen i citratbuffert (PH = 6) och autoklaverades vid 90-C under 15 minuter och fick svalna till rumstemperatur. Objektglasen tvättades med PBS-buffert 4 gånger tillräckligt och vävnadssektionerna inkuberades med primär antikropp; p16INK4a rekombinant monoklonal kaninantikropp (RM267) (MA5-27905) vid en utspädning av 1:500 över natten, följt av inkubation med sekundär antikropp; Polyvalent polymer-HRP i 10 minuter för varje steg följt av tillräckligt 4 gånger PBS-bufferttvätt. Vävnaderna behandlades sedan med diaminobensidinkromogen (DAP-kromogen) för utveckling av brun färg under 10 minuter. Därefter behandlades sektioner med Mayer hematoxylin som motfärgning under 2 minuter.

      För sektioner som endast erhålls från maligna fall lägger vi till ytterligare Ki67 IHC-färgning eftersom vävnadssnitt efter deparffinisering och blockering med 3 % väteperoxidas inkuberades med primär antikropp; Ki67-antikropp (DAKO), redo att användas i 20 minuter, följt av inkubation med sekundär antikropp; Polyvalent polymer-HRP i 20 minuter, följt av behandling med diaminobensidinkromogen (DAP-kromogen) för utveckling av brun färg i 5 minuter. Därefter behandlades sektioner med Mayer hematoxylin som motfärgning under 2 minuter.

      Objektglasen tvättades med kranvatten, dehydrerades genom serieutspädningar av alkohol, tvättades med xylen under en kort period och monterades med DPX.

      De normala uppenbara äggstocksvävnaderna användes som kontroller. Sektioner från cervikalt icke-keratiniserat skivepitelcancer med block p16-uttryck användes som positiva kontroller; och vävnadsglasen utan den primära antikroppsbehandlingen fungerade som negativa kontroller.

      -Immunohistokemisk utvärdering: För P16 IHC-färgning uppskattades andelen P16-positiva celler och placeringen av positiva signaler (nukleära eller cytoplasmatiska) visuellt för neoplastiska komponenter i alla lesioner. Tyska semi-kvantitativa poängsystem användes för att utvärdera P16-uttryck eftersom varje tumör kommer att ges en poäng enligt intensiteten av cytoplasmatisk och nukleinfärgning (ingen färgning = 0, svag färgning = 1, måttlig färgning = 2, stark färgning = 3 ) Och omfattningen av färgade celler (0% = 0, 1-10% = 1, 11-50% =2, 51-80% = 3, 81-100% = 4). Den slutliga immunoreaktiva poängen kommer att bestämmas genom att multiplicera intensitetspoängen med graden av positivitetspoäng för färgade celler, med minsta poäng på 0 och en maximal poäng på 12 (poäng 0, 1,2,3,4,6,8, 9 och 12).

      För KI67 IHC-färgning endast för maligna fall bedömdes procentandelen av nukleär positivitet färgade celler, oavsett färgningsintensitet i alla undersökta sektioner (minst 1000 tumörceller räknades per sektion för uppskattning av KI-index).

      -Statistisk analys: Data analyserades med IBM-SPSS version 24. Numeriska data presenterades som medelvärde och standardavvikelse, medan kategoriska data presenterades som antal och procent. Beskrivande statistik: Medelvärden, standardavvikelser, medianer, intervall och procentsatser beräknades. Signifikanstest: för kontinuerliga variabler med fler än två kategorier; ANOVA-testet beräknades för att testa medelskillnaderna för data som följer normalfördelningen och oberoende prov Kruskal-Wallis användes för att jämföra medianskillnaden mellan grupper som inte följer normalfördelningen, post-hoc-testet beräknades med Bonferroni-korrigeringar. Korrelationsanalys användes (Spearman' Ranking korrelation, 2-tailed).

      Ett p-värde < 0,05 ansågs signifikant.