Valutazione immunoistochimica dell'espressione della proteina P16 nei tumori delle cellule germinali ovariche.

In questo studio ci proponiamo di:

1-Valutare l'espressione immunoistochimica di p16 nella componente neoplastica di OGCT benigni e maligni e valutarne l'immunoreattività.

2-Correlazione tra espressione immunoistochimica di P16 in MOGCT con indice di proliferazione Ki 67 e stadiazione FIGO.

1. Tipo di studio: studio caso-controllo abbinato.

2. Materie di studio:

   1. Criteri di inclusione: Diversi tipi di tumori a cellule germinali ovariche tra cui: benigni (teratoma cistico maturo) e maligni (disgerminoma, teratoma immaturo e tumore del sacco vitellino).

   2. Criteri di esclusione:

      Tutti i criteri che non soddisfano i criteri di inclusione come tumori ovarici resecati diversi dai tumori delle cellule germinali ovariche, ad esempio tumori ovarici epiteliali, tumori stromali del cordone sessuale o lesioni ovariche metastatiche.

      • Il protocollo dello studio è stato approvato dall'Institutional Review Board presso la Faculty of medicine, Assiut University nel dicembre 2019 (IRB n. 17100871) e l'approvazione etica per questo studio è stata ottenuta dal comitato di etica medica, Faculty of medicine, Assiut University.
      • Ambiente di studio: Laboratorio IHC del Dipartimento di Patologia, Facoltà di Medicina, Università Assiut.
      • Campionamento di tessuto: Sessantadue campioni ovarici fissati in formalina e inclusi in paraffina sono stati ottenuti dai dipartimenti di patologia chirurgica dell'Assiut University Hospital (AUH) e del South Egypt cancer Institute (SECI) da gennaio 2010 a gennaio 2021. Questi esemplari includono:

      (Gruppo A) 22 tumori maligni delle cellule germinali ovariche (MOGCT), (Gruppo B) 20 tessuto ovarico normale apparente come gruppo di controllo e (Gruppo C) 20 teratomi cistici maturi come gruppo di confronto benigno uguale.

      Il gruppo A costituisce 5 disgerminomi, 8 teratomi immaturi (quattro dei quali di grado II e gli altri quattro sono di grado III, sistema di classificazione FIGO) e 9 tumori del sacco vitellino. I pazienti avevano un'età compresa tra 12 e 23 anni (età media 16,5 anni). La diagnosi iniziale di ogni MOGCT è stata rivalutata secondo la classificazione dell'OMS dei tumori ovarici.

      Il gruppo B include ovaie normalmente evidenti resecate chirurgicamente con campioni di isterectomia addominale totale e salpingo-oferctomia per cause non ovariche e non maligne come fibroma multiplo dell'utero e adenomiosi come gruppo di controllo. I pazienti avevano un'età compresa tra 42 e 64 anni (mediana 50 anni).

      Tutti i vetrini colorati con ematossilina ed eosina disponibili sono stati esaminati da due patologi indipendenti mediante microscopia ottica di routine e uno o due blocchi di tessuto più rappresentativi sono stati utilizzati per la colorazione immunoistochimica. I dati clinici e patologici comprendenti età, grado, stadio, recidiva delle lesioni sono stati valutati in base a rapporti patologici.

      • Immunoistochimica: i campioni di tessuto erano blocchi di tessuto fissati in formalina, inclusi in paraffina e conservati a temperatura ambiente. Sezioni sottili di 4 um di spessore sono state tagliate da blocchi di tessuto rappresentativi selezionati e sono state portate su vetrini rivestiti, mantenute in un forno a 70-C per 25 minuti, deparaffinate mediante lavaggio in due contenitori di xilene per 15 minuti ciascuno e reidratate attraverso diluizioni seriali (100% , 90% , 80% , 70 %) di alcol per 5 minuti in ciascuna diluizione. Quindi, le sezioni sono state trattate con perossido di idrogeno al 3% per 10 minuti per prevenire uno sfondo non specifico, seguito da lavaggio con tampone PBS 4 volte in modo adeguato. Per il recupero dell'antigene, i vetrini sono stati tenuti in tampone citrato (PH = 6) e autoclavati a 90°C per 15 minuti e lasciati raffreddare a temperatura ambiente. I vetrini sono stati lavati adeguatamente con tampone PBS 4 volte e le sezioni di tessuto sono state incubate con anticorpo primario; p16INK4a Anticorpo monoclonale di coniglio ricombinante (RM267) (MA5-27905) a una diluizione di 1:500 durante la notte, seguito da incubazione con anticorpo secondario; Polimero polivalente-HRP per 10 minuti per ogni passaggio seguito da 4 volte adeguate di lavaggio con tampone PBS. I tessuti sono stati quindi trattati con cromogeno diaminobenzidina (cromogeno DAP) per lo sviluppo del colore marrone per 10 minuti. Quindi, le sezioni sono state trattate con ematossilina Mayer come colorante di contrasto per 2 minuti.

      Per le sezioni ricevute solo da casi maligni, aggiungiamo ulteriore colorazione Ki67 IHC poiché le sezioni di tessuto dopo la deparffinizzazione e il blocco con perossidasi di idrogeno al 3% sono state incubate con l'anticorpo primario; anticorpo Ki67 (DAKO), pronto per l'uso per 20 minuti, seguito da incubazione con anticorpo secondario; Polimero polivalente-HRP per 20 minuti, seguito da trattamento con cromogeno diaminobenzidina (cromogeno DAP) per lo sviluppo del colore marrone per 5 minuti. Quindi, le sezioni sono state trattate con ematossilina Mayer come colorante di contrasto per 2 minuti.

      I vetrini sono stati lavati con acqua di rubinetto, disidratati mediante diluizioni seriali di alcol, lavati con xilene per un breve periodo e montati con DPX.

      I normali tessuti ovarici apparenti sono stati usati come controlli. Come controlli positivi sono state utilizzate sezioni di carcinoma a cellule squamose cervicali non cheratinizzate con blocco dell'espressione di p16; e i vetrini di tessuto senza il trattamento anticorpale primario sono serviti come controlli negativi.

      -Valutazione immunoistochimica: per la colorazione P16 IHC, la percentuale di cellule P16 positive e la posizione dei segnali positivi (nucleari o citoplasmatici) sono state stimate visivamente per i componenti neoplastici di tutte le lesioni. Il sistema di punteggio semi-quantitativo tedesco è stato utilizzato per valutare l'espressione di P16 poiché a ogni tumore verrà assegnato un punteggio in base all'intensità della colorazione citoplasmatica e nucleica (nessuna colorazione = 0, colorazione debole = 1, colorazione moderata = 2, colorazione forte = 3 ) E l'estensione delle cellule colorate (0% = 0, 1-10% = 1, 11-50% = 2, 51-80% = 3, 81-100% = 4). Il punteggio immunoreattivo finale sarà determinato moltiplicando i punteggi di intensità per l'entità dei punteggi di positività delle cellule colorate, con il punteggio minimo di 0 e un punteggio massimo di 12 (punteggio 0, 1,2,3,4,6,8, 9 e 12).

      Per la colorazione IHC KI67 solo per i casi maligni, è stata valutata la percentuale di cellule colorate di positività nucleare, indipendentemente dall'intensità della colorazione in tutte le sezioni esaminate (sono state contate almeno 1000 cellule tumorali per sezione per la stima dell'indice KI).

      -Analisi statistica: i dati sono stati analizzati utilizzando IBM-SPSS versione 24. I dati numerici sono stati presentati come media e deviazione standard, mentre i dati categorici sono stati presentati come numero e percentuale. Statistiche descrittive: sono state calcolate medie, deviazioni standard, mediane, intervalli e percentuali. Test di significatività: per variabili continue con più di due categorie; Il test ANOVA è stato calcolato per testare le differenze medie dei dati che seguono la distribuzione normale e il campione indipendente Kruskal-Wallis è stato utilizzato per confrontare la differenza mediana tra i gruppi che non seguono la distribuzione normale, il test post-hoc è stato calcolato utilizzando le correzioni di Bonferroni. È stata utilizzata l'analisi di correlazione (correlazione classificata di Spearman, a 2 code).

      Un p-value <0,05 è stato considerato significativo.