一项利用循环细胞游离 DNA (cfDNA) 检测晚期结直肠癌患者 RAS 突变的前瞻性研究。

在沙特阿拉伯，结直肠癌仍然是男性中最常见的癌症，在女性中排名第三。 几乎三分之一的患者出现转移性疾病，5 年生存率从 1 期的 90% 显着下降到转移后的 14%。 人们对液体活检的潜力充满热情，可以为突变癌症特征提供易于获取的遗传生物标志物。 表皮生长因子受体 (EGFR) 单克隆抗体广泛用于治疗不携带 RAS 突变（RAS 野生型）的晚期结直肠癌。 因此，在对此类患者进行全身治疗之前，必须对致癌 RAS 突变进行基因分型，因为这些突变的存在预示着对 EGFR 靶向抗体（如西妥昔单抗和帕尼单抗）的耐药性。 转移性 CRC 的治疗变得更加复杂，近年来随着新的致癌（潜在可靶向）途径的发现，精准医学方法也在不断发展。 转移性结直肠癌的预后已从最佳支持治疗的 6 个月改善到多药化疗和包括抗 EGFR 抗体在内的靶向治疗的 2 年以上。 针对 CRC 中的其他单一途径，例如添加血管内皮生长因子抑制剂，也使患者受益。 据估计，55% 的转移性结直肠癌 (mCRC) 患者会在 KRAS 和 NRAS 中发生致癌突变。 此类突变的检测已通过组织活检进行，缺点是这是一种侵入性操作，并且数据表明此类检测可能无法反映疾病的真正突变负担，因为单个组织片段可能不足以反映瘤内异质性。 越来越多的证据表明，液体活检或基于血液的突变分析可以提供更全面的疾病分子概况，并具有微创的优势。 连续液体活检可以作为一种工具来识别空间和时间异质性，预测对靶向药物的反应或耐药性，并且可以揭示可能被新型抗癌药物靶向的特定突变的出现（或消失）。 为了解释这种分子异质性，转移性结直肠癌患者的基因组图谱应在治疗过程中的不同时间点使用液体活检进行检查。

已有小型研究使用液体活检检查 mCRC 中抗 EGFR 单克隆抗体的耐药机制。 一项针对 37 名接受西妥昔单抗治疗的 mCRC 患者的研究发现，其中 40% 的患者在进展 10) 时发生了 RAS 突变。 另一项参与者人数有限的研究检查了接受帕尼单抗治疗的 mCRC 患者，发现 24 名患者中有 9 名 (38%) 在治疗时发生 KRAS 突变，这是抗 EGFR 治疗获得性耐药的一种机制。 此外，在使用 EGFR 单克隆抗体重新挑战 mCRC 患者时，较少的患者数量有限的研究使用液体活检作为生物标志物。 大多数这些研究是回顾性的。 然而，其中一项是第一项前瞻性试验，并且与我们的研究具有相似的方案。 它包括 28 名患者，并报告说这些患者中有 52% 是 RAS 野生型，在再次接受西妥昔单抗治疗时——当这些患者在一线环境中暴露于西妥昔单抗并出现进展时。 该研究表明，当发现 RAS 在循环肿瘤 DNA 上为野生型时，再次使用西妥昔单抗可显着改善无进展生存期 (12)。 本研究的局限性之一是只进行了单一液体活检样本（在再次使用西妥昔单抗之前），因此没有显示研究人员计划在我们的试验中研究的预测的 RAS 靶标“转换”。 此外，最近的一项研究方案已在 BMC 癌症杂志上发表，研究人员计划研究 120 名患者，并在患者接受西妥昔单抗一线治疗时每 3 个月进行一次液体活检分析。 这是为了研究 RAS 靶标的演变，并将其与疾病反应相关联，并帮助指导 mCRC 患者使用 EGFR 抑制剂进行治疗。 然而，基于有限的数据，目前的指南尚未采用使用液体活检和使用该策略来决定是否在第 3 线设置中重新挑战抗 EGFR 治疗的测试，这是研究人员希望在本研究中回答的问题。

循环无细胞 DNA (cfDNA) 由源自正常和死亡细胞的破裂、坏死或细胞凋亡从细胞中释放的小核酸片段组成，现在越来越多地用于检测晚期结直肠癌患者的 RAS（和其他）突变。 有新的证据表明 G12C RAS 突变可以用一种新型抗癌剂作为靶点。

研究人员的目标是对没有 RAS 突变的晚期结直肠癌患者进行 cfDNA 检测，即野生型（因此开始使用 EGFR 抑制剂——这是标准的护理治疗）三线治疗前。 这将帮助主治医师决定是给予这些 RAS wt 状态的患者抗 EGFR 单克隆抗体还是标准的三线疗法（Regorafenib 或 TAS-102）。 这些患者将在 18 个月内收集。 第二次进展时（即三线全身治疗之前）的 cfDNA 测试将确定在进展到一线治疗（或其他突变作为耐药机制）后可能发生 RAS 突变的患者子集是否具有抗 - EGFR 单克隆抗体已经改变了它们的 RAS 状态，变成了野生型。 这将支持 EGFR 抑制剂在三线环境中的重新挑战，并有可能改变结直肠癌治疗指南。 在此基础上，主要研究者将决定是否用抗 EGFR 抑制剂重新挑战。 研究人员的目标是研究总共 60 名患者，并且至少有 30 名患者在再挑战（使用抗 EGFR mAb）组中。

材料和方法

患者将接受肿瘤/转移部位的标准护理 (SOC) 活检，以确认诊断并确定 RAS 状态。 一旦 RAS 野生型和原发疾病为左侧，这些患者将接受标准化疗（选择 FOLFOX、FLOFIRI、CapeOX、XELIRI）和抗 EGFR mAb（西妥昔单抗或帕尼单抗）。 疾病进展后，将根据 SOC 给予二线全身化疗 +/- 抗 VEGF 抗体。 在第二次进展时，患者将根据纳入标准和同意书被纳入研究，并将抽取 cfDNA 血液测试，并检查 RAS 状态。 如果 RAS 是野生型，那么研究者将决定是否重新使用抗 EGFR 抗体（参见研究方案 - 图 1），或给予 SOC 三线化疗（Regorafenib 或 TAS-102）。

根据 SOC，将每 8-12 周使用 CT 扫描和/或 MRI 进行一次疾病评估，并将根据 RECIST 标准 v1.1 进行报告。

来自 CRC 患者的 cfDNA 下一代测序 (NGS) 方法 cfDNA 提取 血液样本将收集在 K2EDTA 管中（BD Vacutainer® Blood Collection Tubes, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA）并送往转化病理学实验室。 通过在室温下以 1600 × g 连续两轮离心 30 分钟，将血浆部分与血细胞分离。 收集的血浆被等分并储存在-80 °C 直到使用。 根据制造商的说明，使用 MagMax 无细胞总核酸分离试剂盒（Thermo Fisher Scientific，Waltham，USA）从 0.4 至 5.5 ml 的血浆中提取 cfDNA。 通过 Qubit 2.0 荧光计 (Thermo Fisher Scientific) 使用 dsDNA HS 测定试剂盒评估 cfDNA 数量。 使用 Agilent Tap Station 系统（安捷伦科技，美国圣克拉拉）评估 cfDNA 质量。 只有在 140-200 bp 之间具有清晰片段大小峰的 cfDNA 样本才会被考虑用于分析。

NGS 文库制备 NGS 文库将根据 Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay (Thermo Fisher Scientific) 从 10 ng cfDNA 制备。 我们的通用文库制备方案基于温度范围为 64 °C 至 58 °C 的双循环多重接触式 PCR 反应，可放大目标区域并引入独特的分子标识符。 然后使用 Agencourt AMPure XP（Beckman Coulter，Brea，USA）以 1.5× 的珠子与样品比率清理产生的约 100-140 bp 长度的标记扩增子，并将纯化的产物洗脱在 24 μl 低 TE 缓冲液中。 第二轮 PCR（18 个循环）将在 50 μl 的总体积中进行，以扩增纯化的扩增子并引入包含样品特异性条形码的 Ion Torrent™ 标签测序接头。 通过使用 Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) 分别以 1.15× 和 1.0× 的珠子与样品比率进行两步清理来纯化目标 DNA 片段的文库。 然后将纯化的文库按 1:1000 稀释，并使用 Ion Universal Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific) 通过 qPCR 进行定量。 然后将量化的库存库稀释至 100 pM，用于下游模板制备。

测序 NGS 文库将使用半导体测序技术在 Ion S5™ 仪器（Thermo Fisher Scientific）上进行测序。 简而言之，计划在 Torrent Suite Software™ v5.10 上运行测序，使用 Ion Chef™ 仪器（Thermo Fisher Scientific）将文库合并并加载到 Ion 540™ 芯片上。 然后使用 500 个流程对加载的芯片进行排序。 原始数据在 Torrent Server™ 上自动处理并与参考 hg19 基因组对齐。 将根据以下指标对每个样本手动执行 QC；每个样本的读数 >15,000,000（对于 Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay 文库 aries），在靶读数 >90%，读数均匀性 >90%，中值分子覆盖率 >500×，中值读数覆盖率 >15,000。 然后根据制造商的说明对组织 NGS 库进行排序。 QC 通过样本的测序数据随后以 BAM 格式上传到 Ion Reporter™ 分析服务器，用于变异检出和注释。

数据分析 对于血浆样本，变异检出是在 Ion Reporter™ (IR) 分析软件 v5.10 上使用 Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0 工作流程进行的。 分析流程还包括信号处理、碱基检出、质量评分分配、接头修整、PCR 重复去除和映射质量控制。 每个扩增子的覆盖率指标是通过运行覆盖率分析插件软件 v5.6 (Thermo Fisher Scientific) 获得的。 只有当变体的分子覆盖度至少为三个时，才考虑识别出的变体，这表明该变体在三个独立的模板分子中被检测到。 最后，使用 Integrative Genomics Viewer 手动审查所有候选突变。 进一步的注释将由 Qiagen QCI 平台和内部 oLIMS 系统执行。