進行性結腸直腸癌患者における RAS 変異の検出における循環無細胞 DNA (cfDNA) の使用を利用した前向き研究。

結腸直腸がんは依然として男性で最も多いがんであり、サウジアラビアでは女性で 3 番目に多いがんです。 転移性疾患の症状は患者のほぼ 3 分の 1 で発生し、5 年生存率はステージ 1 の 90% から、疾患が転移すると 14% に大幅に減少します。 リキッドバイオプシーが変異がんの特徴付けのために簡単にアクセスできる遺伝子バイオマーカーを提供する可能性に熱意があります。 上皮成長因子受容体 (EGFR) モノクローナル抗体は、RAS 変異を持たない進行性結腸直腸癌 (RAS 野生型) の治療に広く使用されています。 したがって、これらの変異の存在は、セツキシマブやパニツムマブなどの EGFR 標的抗体に対する耐性を予測するため、発癌性 RAS 変異のジェノタイピングは、そのような患者の全身療法の開始前に行うことが不可欠です。 転移性CRCの治療はより複雑になり、精密医療のアプローチは、新しい発癌性（潜在的に標的化可能な）経路の発見により近年進化しています。 転移性結腸直腸癌の予後は、最善の支持療法による 6 か月から、多剤化学療法と抗 EGFR 抗体を含む標的療法による 2 年以上に改善されました。 血管内皮増殖因子阻害剤の追加など、CRC の他の単一化経路を標的とすることも、患者に利益をもたらしています。 転移性結腸直腸癌 (mCRC) 患者の 55% が KRAS および NRAS に発癌性変異を有すると推定されています。 そのような変異の検出は組織生検で行われてきましたが、これは侵襲的な手順であるという欠点があり、データは、組織の単一の断片が疾患の真の変異負荷を反映していない可能性があることを示唆しています。腫瘍内異質性。 リキッドバイオプシーまたは血液ベースの突然変異プロファイリングが疾患のより包括的な分子プロファイルを提供できることを示唆する証拠が増えており、侵襲が最小限であるという利点があります。 連続リキッドバイオプシーは、標的薬剤に対する応答または耐性を予測する空間的および時間的不均一性を識別するためのツールとして機能し、新しい抗がん剤の標的となる可能性がある特定の変異の出現 (または消失) に光を当てることができます。 この分子の不均一性を説明するために、リキッドバイオプシーを使用した治療過程のさまざまな時点で、転移性結腸直腸がん患者のゲノムプロファイルを調べる必要があります。

リキッドバイオプシーを使用して、mCRC における抗 EGFR モノクローナル抗体に対する耐性のメカニズムを調べた小規模な研究が行われています。 セツキシマブで治療された 37 人の mCRC 患者を対象とした研究では、その 40% が進行時に RAS 変異を発症した 10)。 限られた数の参加者による別の研究では、パニツムマブで治療された mCRC 患者を調べたところ、24 人中 9 人の患者 (38%) が、抗 EGFR 療法に対する獲得耐性のメカニズムとして、治療中に KRAS 変異を発症したことがわかりました。 さらに、EGFR モノクローナル抗体で mCRC 患者を再チャレンジする際にバイオマーカーとしてリキッドバイオプシーを使用した限られた患者数の研究はほとんどありませんでした。 これらの研究の大部分は遡及的でした。 ただし、1つは最初の前向き試験であり、私たちの研究と同様のプロトコルを持っていました. これには 28 人の患者が含まれ、これらの患者の 52% がセツキシマブによる再チャレンジ時に RAS 野生型であったことが報告されました。 この研究では、循環腫瘍 DNA で RAS が野生型であることが判明した場合、セツキシマブによる再攻撃により無増悪生存期間が大幅に改善されることが示されました(12)。 この研究の限界の 1 つは、単一の液体生検サンプルが (セツキシマブによる再チャレンジの前に) 行われたため、研究者が私たちの試験で研究する予定の RAS ターゲットの予測された「スイッチ」が表示されないことでした。 さらに、より最近の研究プロトコルが BMC Cancer で公開されており、治験責任医師は 120 人の患者を研究し、患者がセツキシマブを一次治療している間、3 か月ごとにリキッドバイオプシー分析を行う予定です。 これは、RAS 標的の進化を研究し、これを疾患反応と相関させ、mCRC 患者の EGFR 阻害剤による治療を導くのに役立ちます。 しかし、限られたデータに基づいて、現在のガイドラインはまだリキッドバイオプシーを使用した検査を採用しておらず、この戦略を使用して 3 次治療で抗 EGFR 療法を再チャレンジするかどうかを決定しており、これは研究者がこの研究で回答したい質問です。

循環セルフリー DNA (cfDNA) は、破裂、壊死、または正常細胞および死んだ細胞に由来するアポトーシスによって細胞から遊離した小さな核酸断片で構成され、現在、進行した結腸直腸癌患者の RAS (およびその他の) 変異を検出するためにますます使用されています。 G12C RAS 突然変異が新しい抗がん剤で標的にできるという新しい証拠があります。

研究者らは、RAS 変異を持たない進行性結腸直腸癌患者、すなわち野生型 (したがって、標準治療である EGFR 阻害剤を開始する) の 3 次治療前の患者に対して cfDNA 検査を実施することを目指しています。 これは、主治医が RAS wt 状態のこれらの患者に抗 EGFR モノクローナル抗体を投与するか、標準的な第 3 選択療法 (レゴラフェニブまたは TAS-102) を投与するかを決定するのに役立ちます。 これらの患者は 18 か月にわたって収集されます。 二次進行時 (すなわち、三次全身療法の前) の cfDNA テストは、抗 - EGFR モノクローナル抗体は、RAS ステータスを切り替えて野生型になりました。 これは、EGFR 阻害剤のサードライン設定における再チャレンジをサポートし、結腸直腸がん治療ガイドラインを変更する可能性を秘めています。 これに基づいて、治験責任医師は、抗EGFR阻害剤で再チャレンジするかどうかを決定します。 研究者は、合計で 60 人の患者を研究することを目指しており、少なくとも 30 人の患者を再投与 (抗 EGFR mAb を使用) グループに入れることを目指しています。

材料および方法

患者は、診断を確認し、RAS 状態を判断するために、腫瘍/転移部位の標準治療 (SOC) 生検を受けます。 RAS 野生型で、原発性疾患が左側にある場合、これらの患者は、抗 EGFR mAb (セツキシマブまたはパニツムマブ) による標準的な化学療法 (FOLFOX、FLOFIRI、CapeOX、XELIRI の選択) を受けます。 疾患が進行すると、二次全身化学療法 +/- 抗 VEGF 抗体が SOC に従って投与されます。 2回目の進行時に、患者は選択基準と同意に従って研究に登録され、cfDNA血液検査が行われ、RASステータスが検査されます。 RAS が野生型の場合、研究者は抗 EGFR 抗体で再チャレンジするか (研究スキームを参照 - 図 1)、SOC の第 3 選択化学療法 (レゴラフェニブまたは TAS-102) を行うかを決定します。

疾患の評価は、CT スキャンおよび/または MRI を使用して SOC に従って 8 ～ 12 週間ごとに行われ、RECIST 基準 v1.1 に従って報告されます。

CRC 患者からの cfDNA 次世代シーケンシング (NGS) の方法 cfDNA 抽出 血液サンプルは K2EDTA チューブ (BD Vacutainer® Blood Collection Tubes、Becton Dickinson、Franklin Lakes、USA) に収集され、Translational Pathology Laboratory に送られます。 血漿画分は、室温で 1600 × g で 30 分間遠心分離を 2 回連続して行うことにより、血球から分離されます。 採取した血漿を等分し、使用するまで-80°Cで保存しました。 製造元の指示に従って、MagMax Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific、米国ウォルサム) を使用して、0.4 ～ 5.5 ml の範囲の血漿量から cfDNA を抽出します。 cfDNA 量は、Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) による dsDNA HS アッセイ キットで評価されました。 cfDNA の品質は、Agilent Tap Station System (Agilent Technologies、米国サンタクララ) で評価されました。 140 ～ 200 bp の間に明確なフラグメント サイズのピークがある cfDNA サンプルのみが分析対象となります。

NGS ライブラリーの調製 NGS ライブラリーは、Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay (Thermo Fisher Scientific) に続いて、10 ng の cfDNA から調製されます。 当社の一般的なライブラリー調製プロトコルは、64 °C から 58 °C の温度範囲での 2 サイクルのマルチプレックス タッチダウン PCR 反応に基づいており、ターゲット領域を増幅し、一意の分子識別子を導入することができます。 得られた長さ約 100 ～ 140 bp のタグ付きアンプリコンは、Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter、Brea、USA) を使用してビーズ対サンプル比 1.5 倍でクリーンアップされ、精製された生成物は 24 μl 低 TE バッファーで溶出されます。 2 回目の PCR (18 サイクル) は、精製されたアンプリコンを増幅し、サンプル固有のバーコードを含む Ion Torrent™ Tag-Sequencing アダプターを導入するために、総量 50 μl で実行されます。 得られた標的ＤＮＡ断片のライブラリーは、Ａｇｅｎｃｏｕｒｔ ＡＭＰｕｒｅ ＸＰ（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を用いてビーズ対サンプル比それぞれ１．１５×および１．０×で２段階クリーンアップを行うことにより精製される。 次に、精製したライブラリーを 1:1000 に再希釈し、Ion Universal Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific) を使用して qPCR で定量化します。 定量化されたストック ライブラリは、下流のテンプレートの準備のために 100 pM に希釈されます。

シーケンス NGS ライブラリは、半導体シーケンス技術を使用して Ion S5™ 装置 (Thermo Fisher Scientific) でシーケンスされます。 手短に言えば、シーケンス実行は Torrent Suite Software™ v5.10 で計画され、ライブラリーはプールされ、Ion Chef™ 機器 (Thermo Fisher Scientific) を使用して Ion 540™ チップにロードされます。 ロードされたチップは、500 フローを使用してシーケンスされます。 生データは Torrent Server™ で自動的に処理され、参照 hg19 ゲノムにアラインされます。 QC は、次の指標に基づいて各サンプルに対して手動で実行されます。サンプルあたりの読み取り数 > 15,000,000 (Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay ライブラリ aries の場合)、オンターゲット読み取り > 90%、読み取り均一性 > 90%、分子カバレッジの中央値 > 500x、読み取りカバレッジの中央値 > 15,000。 組織 NGS ライブラリは、製造元の指示に従ってシーケンスされます。 QC 合格サンプルのシーケンス データは、BAM 形式で Ion Reporter™ 分析サーバーにアップロードされ、バリアント コールとアノテーションが行われます。

データ分析 血漿サンプルのバリアント コールは、Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0 ワークフローを使用して、Ion Reporter™ (IR) Analysis Software v5.10 で実行されます。 分析パイプラインには、シグナル処理、塩基呼び出し、品質スコアの割り当て、アダプターのトリミング、PCR 重複の除去、およびマッピング品質の制御も含まれます。 各アンプリコンのカバレッジ メトリックは、Coverage Analysis Plugin ソフトウェア v5.6 (Thermo Fisher Scientific) を実行することによって取得されます。 識別されたバリアントは、バリアントが少なくとも 3 つの分子範囲を持っていた場合にのみ考慮されます。これは、バリアントが 3 つの独立したテンプレート分子で検出されることを示します。 最後に、Integrative Genomics Viewer を使用して、すべての候補変異を手動で確認します。 さらなる注釈は、Qiagen QCI プラットフォームと社内の oLIMS システムによって実行されます。