Проспективное исследование с использованием циркулирующей свободной клеточной ДНК (вкДНК) для обнаружения мутаций RAS у пациентов с прогрессирующим колоректальным раком.

Колоректальный рак остается самым распространенным видом рака среди мужчин и третьим по распространенности среди женщин в Саудовской Аравии. Представление с метастатическим заболеванием происходит почти у одной трети пациентов, при этом 5-летняя выживаемость значительно снижается с 90% на стадии 1 до 14% после метастазирования заболевания. Существует энтузиазм в отношении потенциала жидкой биопсии в качестве легкодоступных генетических биомаркеров для характеристики мутационного рака. Моноклональные антитела к рецептору эпидермального фактора роста (EGFR) широко используются при лечении распространенного колоректального рака, не содержащего мутаций RAS (RAS дикого типа). Следовательно, генотипирование онкогенных мутаций RAS необходимо проводить до начала системной терапии для таких пациентов, поскольку наличие этих мутаций предсказывает резистентность к антителам, нацеленным на EGFR, таким как цетуксимаб и панитумумаб. Лечение метастатического КРР стало более сложным, и в последние годы появились подходы к прецизионной медицине с открытием новых онкогенных (потенциально таргетных) путей. Прогноз при метастатическом колоректальном раке улучшился с 6 месяцев при наилучшей поддерживающей терапии до более чем 2 лет при многокомпонентной химиотерапии и таргетной терапии, включая антитела против EGFR. Нацеливание на другие одиночные пути при CRC, такие как добавление ингибиторов фактора роста эндотелия сосудов, также принесло пользу пациентам. Подсчитано, что 55% пациентов с метастатическим колоректальным раком (мКРР) будут иметь онкогенные мутации в KRAS и NRAS. Обнаружение таких мутаций проводилось на биоптатах тканей, недостатком которых было то, что это инвазивная процедура, и данные, свидетельствующие о том, что такое тестирование может не отражать истинное мутационное бремя болезни, поскольку один фрагмент ткани может быть недостаточным для отражения внутриопухолевая гетерогенность. Появляется все больше данных, свидетельствующих о том, что жидкая биопсия или мутационное профилирование на основе крови могут обеспечить более полный молекулярный профиль заболевания и обладают тем преимуществом, что являются минимально инвазивными. Серийные жидкостные биопсии могут выступать в качестве инструмента для выявления пространственной и временной гетерогенности, предсказывающей реакцию или резистентность к таргетным агентам, и могут пролить свет на появление (или исчезновение) специфических мутаций, которые потенциально могут быть нацелены на новые противораковые агенты. Чтобы учесть эту молекулярную гетерогенность, геномные профили пациентов с метастатическим колоректальным раком следует исследовать в разные моменты времени в течение курса терапии с использованием жидкой биопсии.

Были проведены небольшие исследования, в которых изучались механизмы резистентности к моноклональным антителам против EGFR при мКРР с использованием жидкой биопсии. Исследование 37 пациентов с мКРР, получавших цетуксимаб, показало, что у 40% из них развились мутации RAS при прогрессировании 10). В другом исследовании с ограниченным числом участников изучались пациенты с мКРР, получавшие лечение панитумумабом, и было обнаружено, что у 9 из 24 пациентов (38%) во время лечения развились мутации KRAS как механизм приобретенной устойчивости к анти-EGFR-терапии. Кроме того, в меньшем числе исследований с ограниченным числом пациентов жидкая биопсия использовалась в качестве биомаркера при повторном заражении пациентов с мКРР моноклональными антителами к EGFR. Большинство этих исследований были ретроспективными. Однако одно из них было первым проспективным испытанием и имело протокол, аналогичный нашему исследованию. В него было включено 28 пациентов, и сообщалось, что у 52% этих пациентов был RAS дикого типа при повторном заражении цетуксимабом, когда эти пациенты подвергались воздействию цетуксимаба и прогрессировали на фоне лечения цетуксимабом в условиях первой линии. Это исследование показало, что повторная стимуляция цетуксимабом значительно улучшила выживаемость без прогрессирования, когда было обнаружено, что RAS является диким типом на циркулирующей опухолевой ДНК (12). Одним из ограничений этого исследования было то, что был сделан один образец жидкой биопсии (до повторного заражения цетуксимабом) и, следовательно, не было предсказано «переключение» мишени RAS, которое исследователи планируют изучить в нашем исследовании. Кроме того, более свежий протокол исследования был опубликован в BMC Cancer, где исследователи планируют обследовать 120 пациентов и проводить анализ жидкостной биопсии каждые 3 месяца, пока пациенты получают цетуксимаб первой линии. Это должно изучить эволюцию мишени RAS и сопоставить ее с реакцией на заболевание, а также помочь направить терапию ингибиторами EGFR у пациентов с мКРР. Однако, основываясь на ограниченных данных, текущие рекомендации еще не приняли тестирование с использованием жидкой биопсии и использование этой стратегии для принятия решения о повторной провокации анти-EGFR-терапии в условиях 3-й линии или нет, что является вопросом, на который исследователи хотели бы ответить в этом исследовании.

Циркулирующая внеклеточная ДНК (вкДНК) состоит из небольших фрагментов нуклеиновых кислот, высвобождаемых из клеток в результате разрыва, некроза или апоптоза, происходящих из нормальных и умерших клеток, и в настоящее время все чаще используется для обнаружения мутаций RAS (и других) у пациентов с прогрессирующим колоректальным раком. Имеются новые доказательства того, что мутация G12C RAS ​​может быть нацелена на новый противораковый агент.

Исследователи стремятся провести тестирование вкДНК у пациентов с прогрессирующим колоректальным раком, у которых нет мутаций RAS, то есть дикого типа (и, следовательно, они начинают с ингибиторов EGFR, что является стандартом лечения) перед терапией третьей линии. Это поможет лечащему врачу решить, следует ли назначать этим пациентам со статусом RAS wt моноклональные антитела против EGFR или стандартную терапию третьей линии (Регорафениб или TAS-102). Эти пациенты будут собираться в течение 18 месяцев. Тест вкДНК при втором прогрессировании (т. е. перед системной терапией третьей линии) определит, есть ли у подмножества пациентов, у которых могла развиться мутация (мутации) RAS после перехода на терапию первой линии (или другие мутации как механизм резистентности) с анти- Моноклональные антитела EGFR изменили свой статус RAS и стали дикого типа. Это поддержит повторную провокацию ингибиторов EGFR в условиях третьей линии и может изменить рекомендации по лечению колоректального рака. После этого главный исследователь решит, следует ли повторно ввести анти-ингибитор EGFR. Исследователи стремятся обследовать в общей сложности 60 пациентов и включить как минимум 30 пациентов в группу повторного введения (с mAb против EGFR).

Материалы и методы

Пациентам будет проводиться стандартная биопсия опухоли/места метастазирования (SOC) для подтверждения диагноза и определения статуса RAS. Как только RAS дикого типа и первичное заболевание становится левосторонним, эти пациенты будут получать стандартную химиотерапию (выбор FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI) с mAb против EGFR (цетуксимаб или панитумумаб). При прогрессировании заболевания будет назначена системная химиотерапия второй линии +/- антитело против VEGF в соответствии с SOC. После второго прогрессирования пациенты будут включены в исследование в соответствии с критериями включения и согласием, будет проведен анализ крови на вкДНК и будет изучен статус RAS. Если RAS является диким типом, то исследователь должен решить, следует ли повторно ввести антитело против EGFR (см. схему исследования - рисунок 1) или назначить химиотерапию третьей линии SOC (Регорафениб или TAS-102).

Оценка заболевания будет проводиться каждые 8–12 недель в соответствии с SOC с использованием компьютерной томографии и/или МРТ и будет сообщаться в соответствии с критериями RECIST версии 1.1.

Методы секвенирования вкДНК нового поколения (NGS) у пациентов с КРР Экстракция внДНК Образцы крови будут собираться в пробирки с K2ЭДТА (пробирки для сбора крови BD Vacutainer®, Becton Dickinson, Франклин Лейкс, США) и отправляться в Лабораторию трансляционной патологии. Фракция плазмы будет отделена от клеток крови путем двух последовательных циклов центрифугирования в течение 30 минут при комнатной температуре при 1600×g. Собранную плазму разделяли на аликвоты и хранили при температуре -80°C до использования. вкДНК выделяют из плазмы объемом от 0,4 до 5,5 мл с использованием набора для выделения полных нуклеиновых кислот MagMax Cell-Free (Thermo Fisher Scientific, Уолтем, США) в соответствии с инструкциями производителя. Количество вкДНК оценивали с помощью набора для анализа двухцепочечной ДНК на флуорометре Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific). Качество вкДНК оценивали с помощью системы Agilent Tap Station (Agilent Technologies, Санта-Клара, США). Для анализа будут рассматриваться только образцы вкДНК с четким пиком размера фрагмента между 140-200 п.н.

Подготовка библиотеки NGS Библиотеки NGS готовят из 10 нг вкДНК после бесклеточного анализа Oncomine™ Pan-Cancer (Thermo Fisher Scientific). Наш общий протокол подготовки библиотеки основан на двухцикловой мультиплексной реакции ПЦР приземления с диапазоном температур от 64 ° C до 58 ° C, что позволило амплифицировать области-мишени и ввести уникальные молекулярные идентификаторы. Полученные меченые ампликоны длиной около 100–140 п.н. затем очищают с использованием Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Бреа, США) при отношении гранул к образцу 1,5×, а очищенные продукты элюируют в 24 мкл буфера с низкой ТЕ. Будет проведен второй раунд ПЦР (18 циклов) в общем объеме 50 мкл для амплификации очищенных ампликонов и введения адаптеров Ion Torrent™ Tag-Sequencing, содержащих штрих-коды для конкретных образцов. Полученную библиотеку фрагментов ДНК-мишеней очищают, выполняя двухэтапную очистку с использованием Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) при соотношении шариков к образцу 1,15× и 1,0× соответственно. Затем очищенные библиотеки повторно разбавляли 1:1000 и количественно определяли с помощью количественной ПЦР с использованием набора Ion Universal Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific). Количественно оцененные исходные библиотеки затем разбавляют до 100 пМ для последующей подготовки матрицы.

Секвенирование Библиотеки NGS будут секвенированы на приборе Ion S5™ (Thermo Fisher Scientific) с использованием технологии полупроводникового секвенирования. Вкратце, циклы секвенирования планируются в Torrent Suite Software™ v5.10, библиотеки объединяются и загружаются в чип Ion 540™ с использованием инструмента Ion Chef™ (Thermo Fisher Scientific). Затем загруженный чип секвенируется с использованием 500 потоков. Необработанные данные автоматически обрабатываются на Torrent Server™ и выравниваются с эталонным геномом hg19. КК будет выполняться вручную для каждого образца на основе следующих показателей; количество прочтений на образец> 15 000 000 (для библиотек бесклеточных анализов Oncomine™ Pan-Cancer™), целевые считывания >90%, однородность считываний >90%, медиана молекулярного охвата >500×, медиана охвата считываний >15000. Затем библиотеки тканей NGS секвенируют в соответствии с инструкциями производителя. Затем данные секвенирования образцов, прошедших контроль качества, загружаются в формате BAM на сервер анализа Ion Reporter™ для вызова вариантов и аннотации.

Анализ данных Для образцов плазмы вызов вариантов выполняется с помощью аналитического программного обеспечения Ion Reporter™ (IR) версии 5.10 с использованием рабочих процессов Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0. Конвейер анализа также включает обработку сигналов, базовый вызов, присвоение оценки качества, обрезку адаптера, удаление дубликатов PCR и контроль качества картирования. Показатели покрытия для каждого ампликона получаются с помощью программного обеспечения для анализа покрытия v5.6 (Thermo Fisher Scientific). Идентифицированные варианты рассматриваются только в том случае, если вариант имел молекулярное покрытие не менее трех, что указывает на то, что вариант обнаружен в трех независимых молекулах матрицы. Наконец, все мутации-кандидаты просматриваются вручную с помощью Integrative Genomics Viewer. Дальнейшее аннотирование будет выполняться платформой Qiagen QCI и собственной системой oLIMS.