En prospektiv studie med användning av cirkulerande cellfritt DNA (cfDNA) vid upptäckt av RAS-mutationer hos patienter med avancerad kolorektal cancer.

Kolorektal cancer är fortfarande den vanligaste cancerformen bland män och den tredje vanligaste bland kvinnor i Saudiarabien. Presentation av metastaserande sjukdom förekommer hos nästan en tredjedel av patienterna, där 5-årsöverlevnaden minskar signifikant från 90 % i stadium 1 till 14 % när sjukdomen väl är metastaserad. Det finns entusiasm i potentialen för flytande biopsier att tillhandahålla lättillgängliga genetiska biomarkörer för karaktärisering av mutationscancer. Epidermal tillväxtfaktorreceptor (EGFR) monoklonala antikroppar används i stor utsträckning vid behandling av avancerad kolorektal cancer som inte har RAS-mutationer (RAS-vildtyp). Därför är genotypning av onkogena RAS-mutationer väsentlig för att göras innan systemisk behandling påbörjas för sådana patienter eftersom närvaron av dessa mutationer förutsäger resistens mot EGFR-riktade antikroppar såsom cetuximab och panitumumab. Behandling av metastaserande CRC har blivit mer komplex och precisionsmedicinska tillvägagångssätt har utvecklats under de senaste åren med upptäckten av nya onkogena (potentiellt målbara) vägar. Prognosen för metastaserande kolorektal cancer har förbättrats från 6 månader med bästa stödjande vård till mer än 2 år med multi-agens kemo och riktad terapi inklusive anti-EGFR-antikroppar. Att inrikta sig på andra singelvägar i CRC, såsom tillsats av vaskulära endoteltillväxtfaktorhämmare, har också gynnat patienterna. Det uppskattas att 55 % av patienterna med metastaserande kolorektal cancer (mCRC) kommer att ha onkogena mutationer i KRAS och NRAS. Detektering av sådana mutationer har gjorts på vävnadsbiopsier med nackdelen att detta är en invasiv procedur, och data som tyder på att sådana tester kanske inte återspeglar den verkliga mutationsbördan av sjukdomen eftersom ett enda fragment av vävnad kan vara otillräckligt för att återspegla intratumoral heterogenitet. Det finns allt fler bevis som tyder på att flytande biopsier eller blodbaserad mutationsprofilering kan ge en mer omfattande molekylär profil av sjukdomen och har fördelen av att vara minimalt invasiv. Seriella flytande biopsier kan fungera som ett verktyg för att identifiera rumslig och tidsmässig heterogenitet som förutsäger svar eller resistens mot målinriktade medel, och kan kasta ljus över uppkomsten (eller försvinnandet) av specifika mutationer som potentiellt kan riktas mot nyare anticancermedel. För att ta hänsyn till denna molekylära heterogenitet bör de genomiska profilerna hos patienter med metastaserande kolorektalcancer undersökas vid olika tidpunkter under behandlingsförloppet med hjälp av flytande biopsi.

Det har gjorts små studier som undersökt mekanismer för resistens mot anti-EGFR monoklonala antikroppar i mCRC med hjälp av flytande biopsi. En studie av 37 mCRC-patienter som behandlades med cetuximab fann att 40 % av dem utvecklade RAS-mutationer vid progression 10). En annan studie med begränsat antal deltagare undersökte patienter med mCRC som behandlats med panitumumab och fann att 9 av 24 patienter (38%) utvecklade KRAS-mutationer på behandling som en mekanism för förvärvad resistens mot anti-EGFR-terapi. Vidare använde färre studier med ett begränsat antal patienter flytande biopsi som en biomarkör vid återutmaning av mCRC-patienter med EGFR monoklonala antikroppar. Majoriteten av dessa studier var retrospektiva. En var dock den första prospektiva studien och hade ett liknande protokoll som vår studie. Den inkluderade 28 patienter och rapporterade att 52 % av dessa patienter var RAS-vildtyp vid återutmaning med cetuximab - när dessa patienter exponerades för och utvecklades på cetuximab i första linjen. Denna studie visade att återutmaning med cetuximab signifikant förbättrade progressionsfri överlevnad när RAS visade sig vara vildtyp på cirkulerande tumör-DNA(12). En av begränsningarna i denna studie var att ett enda flytande biopsiprov gjordes (före återutmaning med cetuximab) och visar därför inte den förutsagda "switchen" av RAS-målet, som utredarna planerar att studera i vår studie. Dessutom har ett nyare studieprotokoll publicerats på BMC Cancer där utredarna planerar att studera 120 patienter och utföra flytande biopsianalys var tredje månad medan patienterna är på första linjens cetuximab. Detta för att studera utvecklingen av RAS-målet, och för att korrelera detta med sjukdomssvar, samt hjälpa till att styra terapi med EGFR-hämmare hos mCRC-patienter. Men baserat på begränsade data har nuvarande riktlinjer ännu inte antagit testning med flytande biopsi och med denna strategi för att besluta om återutmaning av anti EGFR-terapi i 3:e linjens inställning eller inte, vilket är frågan utredarna skulle vilja besvara i denna studie.

Cirkulerande cellfritt DNA (cfDNA) består av små nukleinsyrafragment som frigjorts från celler genom ruptur, nekros eller apoptos som härrör från normala och avlidna celler, och används nu alltmer för att upptäcka RAS (och andra) mutationer hos patienter med avancerad kolorektal cancer. Det finns nya bevis för att G12C RAS-mutation kan riktas mot ett nytt anticancermedel.

utredarna syftar till att utföra cfDNA-tester på patienter med avancerad kolorektal cancer som inte har några RAS-mutationer, dvs vildtyp (och därmed börja på EGFR-hämmare - vilket är standardbehandling) före tredje linjens terapi. Detta kommer att hjälpa den behandlande läkaren att bestämma om de ska ge dessa patienter med RAS wt-status en anti-EGFR monoklonal antikropp eller standard tredje linjens terapi (Regorafenib eller TAS-102). Dessa patienter kommer att samlas in under en 18 månaders period. cfDNA-testet vid andra progression (dvs före tredje linjens systemisk terapi) kommer att avgöra om undergruppen av patienter som kan ha utvecklat RAS-mutation(er) efter progression till första linjens terapi (eller andra mutationer som en mekanism för resistens) med anti- EGFR monoklonala antikroppar har ändrat sin RAS-status och blivit vildtyp. Detta kommer att stödja återutmaningen av EGFR-hämmare i tredje linjen, och har potential att ändra riktlinjerna för behandling av kolorektal cancer. Efter detta kommer huvudutredaren att besluta om den ska utmanas igen med anti-EGFR-hämmare. Utredarna siktar på att studera totalt 60 patienter och ha minst 30 patienter i gruppen som återupptas (med anti-EGFR mAb).

Material och metoder

Patienterna kommer att få sin standardvårdsbiopsi (SOC) av tumör/metastaseringsställe för att bekräfta diagnosen och fastställa RAS-status. När RAS vildtyp och primär sjukdom är vänstersidig kommer dessa patienter att få standardkemoterapi (val av FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI) med en anti-EGFR mAb (cetuximab eller panitumumab). Vid fortskridande av sjukdomen kommer andra linjens systemisk kemoterapi +/- anti VEGF-antikropp att ges enligt SOC. Vid andra progression kommer patienter att registreras i studien enligt inklusionskriterier och samtycke, och ett cfDNA-blodprov kommer att tas och RAS-status kommer att undersökas. Om RAS är vildtyp, kommer utredaren att bestämma om den ska utmanas igen med en anti-EGFR-antikropp (se studieschema - figur 1), eller ge SOC tredje linjens kemoterapi (Regorafenib eller TAS-102).

Sjukdomsbedömningar kommer att göras var 8-12:e vecka enligt SOC med hjälp av CT-skanningar och/eller MRI, och kommer att rapporteras enligt RECIST-kriterierna v1.1.

Metoder för cfDNA Next Generation Sequencing (NGS) från CRC-patienter cfDNA-extraktion Blodprover kommer att samlas in i K2EDTA-rör (BD Vacutainer® Blood Collection Tubes, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) och skickas till Translational Pathology Laboratory. Plasmafraktionen kommer att separeras från blodkropparna genom två på varandra följande omgångar av centrifugering i 30 minuter vid rumstemperatur vid 1600 × g. Den uppsamlade plasman alikvoterades och förvarades vid -80°C fram till användning. cfDNA extraheras från plasmavolymer från 0,4 till 5,5 ml med MagMax Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) enligt tillverkarens instruktioner. CfDNA-mängden utvärderades med dsDNA HS-analyskitet med Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific). cfDNA-kvaliteten utvärderades med Agilent Tap Station System (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Endast cfDNA-prover med en tydlig fragmentstorlekstopp mellan 140-200 bp kommer att övervägas för analys.

NGS-biblioteksförberedelser NGS-bibliotek kommer att beredas från 10 ng cfDNA efter Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay (Thermo Fisher Scientific). Vårt allmänna biblioteksförberedelseprotokoll är baserat på en tvåcykls multiplex touch-down PCR-reaktion med ett temperaturområde från 64 °C till 58 °C, vilket gjorde det möjligt att förstärka målregioner och introducera unika molekylära identifierare. De resulterande märkta amplikonerna med en längd på cirka 100-140 bp rensas sedan upp med Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, USA) vid ett förhållande mellan pärla och prov på 1,5 × och renade produkter elueras i 24 μl låg TE-buffert. En andra omgång PCR (18 cykler) kommer att utföras i en total volym på 50 μl för att amplifiera de renade amplikonerna och introducera Ion Torrent™ Tag-Sequencing-adaptrar som innehåller provspecifika streckkoder. Det resulterande biblioteket av mål-DNA-fragment kommer att renas genom att utföra en tvåstegsrensning med Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) vid ett förhållande mellan pärlor och prov på 1,15× respektive 1,0×. De renade biblioteken späddes sedan ut 1:1000 och kvantifierades med qPCR med hjälp av Ion Universal Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific). De kvantifierade stambiblioteken späds sedan till 100 pM för framställning av mall nedströms.

Sekvensering av NGS-bibliotek kommer att sekvenseras på ett Ion S5™-instrument (Thermo Fisher Scientific) med hjälp av halvledarsekvenseringsteknologi. Kortfattat, sekvenseringskörningar planeras på Torrent Suite Software™ v5.10, biblioteken poolas och laddas på ett Ion 540™-chip med hjälp av Ion Chef™-instrumentet (Thermo Fisher Scientific). Det laddade chippet sekvenseras sedan med 500 flöden. Rådata bearbetas automatiskt på Torrent Server™ och anpassas till referens-hg19-genomet. QC kommer att utföras manuellt för varje prov baserat på följande mätvärden; antal läsningar per prov >15 000 000 (för Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay-bibliotek), avläsningar på mål >90 %, läsenhetlighet >90 %, medianmolekylär täckning >500×, medianavläsningstäckning >15 000. Vävnads-NGS-bibliotek sekvenseras sedan enligt tillverkarens instruktioner. Sekvenseringsdata för de QC-passerande proverna laddas sedan upp i BAM-format till Ion Reporter™ Analysis Server för variantanrop och anteckningar.

Dataanalys För plasmaprover utförs variantanrop på Ion Reporter™ (IR) Analysis Software v5.10 med Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0-arbetsflöden. Analyspipelinen inkluderar också signalbehandling, basanrop, kvalitetspoängtilldelning, adaptertrimning, borttagning av PCR-dubbletter och kontroll av kartkvaliteten. Täckningsmått för varje amplikon erhålls genom att köra programvaran Coverage Analysis Plugin v5.6 (Thermo Fisher Scientific). Identifierade varianter beaktas endast om varianten hade en molekylär täckning på minst tre, vilket indikerar att varianten detekteras i tre oberoende mallmolekyler. Slutligen granskas alla kandidatmutationer manuellt med hjälp av Integrative Genomics Viewer. Ytterligare kommentarer kommer att utföras av Qiagen QCI-plattformen och det interna oLIMS-systemet.