Um estudo prospectivo utilizando o uso de DNA livre de células circulantes (cfDNA) na detecção de mutações RAS em pacientes com câncer colorretal avançado.

O câncer colorretal continua sendo o câncer mais comum entre os homens e o terceiro mais comum entre as mulheres na Arábia Saudita. A apresentação com doença metastática ocorre em quase um terço dos pacientes, com a sobrevida em 5 anos diminuindo significativamente de 90% no estágio 1 para 14% quando a doença é metastática. Há entusiasmo no potencial das biópsias líquidas para fornecer biomarcadores genéticos facilmente acessíveis para a caracterização do câncer mutacional. Os anticorpos monoclonais do receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR) são amplamente utilizados no tratamento do câncer colorretal avançado que não abriga mutações RAS (RAS selvagem). Portanto, a genotipagem de mutações RAS oncogênicas é essencial antes do início da terapia sistêmica para esses pacientes, pois a presença dessas mutações prediz resistência a anticorpos direcionados ao EGFR, como cetuximabe e panitumumabe. O tratamento do CCR metastático tornou-se mais complexo e as abordagens da medicina de precisão evoluíram nos últimos anos com a descoberta de novas vias oncogênicas (potencialmente direcionáveis). O prognóstico do câncer colorretal metastático melhorou de 6 meses com os melhores cuidados de suporte para mais de 2 anos com quimioterapia multiagente e terapia direcionada incluindo anticorpos anti EGFR. O direcionamento de outras vias únicas no CRC, como a adição de inibidores do fator de crescimento endotelial vascular, também beneficiou os pacientes. Estima-se que 55% dos pacientes com câncer colorretal metastático (mCRC) terão mutações oncogênicas em KRAS e NRAS. A detecção de tais mutações foi feita em biópsias de tecido com a desvantagem de ser um procedimento invasivo, e os dados sugerem que tal teste pode não refletir a verdadeira carga mutacional da doença, uma vez que um único fragmento de tecido pode ser inadequado para refletir o heterogeneidade intratumoral. Há evidências crescentes sugerindo que biópsias líquidas ou perfis mutacionais baseados no sangue podem fornecer um perfil molecular mais abrangente da doença e carregam a vantagem de serem minimamente invasivos. As biópsias líquidas em série podem atuar como uma ferramenta para identificar a heterogeneidade espacial e temporal, predizendo a resposta ou resistência a agentes direcionados e podem lançar luz sobre o surgimento (ou desaparecimento) de mutações específicas que podem potencialmente ser alvo de novos agentes anti-câncer. Para explicar essa heterogeneidade molecular, os perfis genômicos de pacientes com câncer colorretal metastático devem ser examinados em diferentes momentos durante o curso da terapia usando biópsia líquida.

Houve pequenos estudos que examinaram os mecanismos de resistência aos anticorpos monoclonais anti EGFR em mCRC usando biópsia líquida. Um estudo de 37 pacientes com mCRC tratados com cetuximabe constatou que 40% deles desenvolveram mutações RAS na progressão 10). Outro estudo com número limitado de participantes examinou pacientes com mCRC tratados com panitumumabe e descobriu que 9 de 24 pacientes (38%) desenvolveram mutações KRAS no tratamento como um mecanismo de resistência adquirida à terapia anti-EGFR. Além disso, menos estudos com número limitado de pacientes usaram biópsia líquida como um biomarcador ao desafiar novamente pacientes com mCRC com anticorpos monoclonais EGFR. A maioria desses estudos foi retrospectiva. No entanto, um foi o primeiro estudo prospectivo e teve um protocolo semelhante ao nosso estudo. Ele incluiu 28 pacientes e relatou que 52% desses pacientes eram RAS do tipo selvagem na reexposição com cetuximabe - quando esses pacientes foram expostos e progrediram com cetuximabe no cenário de primeira linha. Este estudo mostrou que o novo desafio com cetuximabe melhorou significativamente a sobrevida livre de progressão quando o RAS era do tipo selvagem no DNA tumoral circulante(12). Uma das limitações deste estudo foi que uma única amostra de biópsia líquida foi feita (antes do novo desafio com cetuximabe) e, portanto, não exibe a "mudança" prevista do alvo RAS, que os investigadores planejam estudar em nosso estudo. Além disso, um protocolo de estudo mais recente foi publicado no BMC Cancer, onde os investigadores planejam estudar 120 pacientes e realizar análises de biópsia líquida a cada 3 meses, enquanto os pacientes estão recebendo cetuximabe de primeira linha. Isso é para estudar a evolução do alvo RAS e correlacioná-lo com a resposta à doença, bem como ajudar a orientar a terapia com inibidores de EGFR em pacientes com mCRC. No entanto, com base em dados limitados, as diretrizes atuais ainda não adotaram o teste usando biópsia líquida e usando essa estratégia para decidir sobre o novo desafio da terapia anti-EGFR na configuração de 3ª linha ou não, que é a pergunta que os investigadores gostariam de responder neste estudo.

O DNA livre de células circulantes (cfDNA) consiste em pequenos fragmentos de ácido nucleico liberados das células por ruptura, necrose ou apoptose originários de células normais e mortas, e agora está sendo cada vez mais usado para detectar mutações RAS (e outras) em pacientes com câncer colorretal avançado. Há novas evidências de que a mutação G12C RAS ​​pode ser alvo de um novo agente anti-câncer.

os investigadores pretendem realizar testes de cfDNA em pacientes com câncer colorretal avançado que não têm mutações RAS, ou seja, tipo selvagem (e, portanto, iniciar com inibidores de EGFR - que é o padrão de tratamento) antes da terapia de terceira linha. Isso ajudará o médico assistente a decidir se deve administrar a esses pacientes com status RAS wt um anticorpo monoclonal anti-EGFR ou uma terapia padrão de terceira linha (Regorafenib ou TAS-102). Esses pacientes serão coletados ao longo de um período de 18 meses. O teste de cfDNA na segunda progressão (ou seja, antes da terapia sistêmica de terceira linha) determinará se o subconjunto de pacientes que podem ter desenvolvido mutação(ões) RAS após a progressão para a terapia de primeira linha (ou outras mutações como mecanismo de resistência) com anti- Os anticorpos monoclonais EGFR mudaram seu status RAS e se tornaram do tipo selvagem. Isso apoiará o novo desafio dos inibidores de EGFR no cenário de terceira linha e tem o potencial de alterar as diretrizes de tratamento do câncer colorretal. Após isso, o investigador principal decidirá se fará um novo desafio com o inibidor anti EGFR. Os investigadores pretendem estudar 60 pacientes no total e ter pelo menos 30 pacientes no grupo de reintrodução (com mAb anti EGFR).

Materiais e métodos

Os pacientes terão sua biópsia padrão de atendimento (SOC) do tumor/local metastático para confirmar o diagnóstico e determinar o status do RAS. Uma vez que o tipo selvagem de RAS e a doença primária são do lado esquerdo, esses pacientes receberão quimioterapia padrão (opções de FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI) com um mAb anti EGFR (cetuximabe ou panitumumabe). Após a progressão da doença, quimioterapia sistêmica de segunda linha +/- anticorpo anti-VEGF será administrado de acordo com o SOC. Após a segunda progressão, os pacientes serão inscritos no estudo de acordo com os critérios de inclusão e consentimento, e um exame de sangue cfDNA será realizado e o status do RAS será examinado. Se o RAS for do tipo selvagem, o investigador decidirá se fará um novo desafio com um anticorpo anti EGFR (consulte o esquema do estudo - figura 1) ou administrará quimioterapia SOC de terceira linha (Regorafenib ou TAS-102).

As avaliações da doença serão feitas a cada 8 a 12 semanas de acordo com o SOC usando tomografias computadorizadas e/ou ressonância magnética, e serão relatadas de acordo com os critérios RECIST v1.1.

Métodos para Sequenciamento de Próxima Geração de cfDNA (NGS) de pacientes com CRC Extração de cfDNA As amostras de sangue serão coletadas em tubos K2EDTA (BD Vacutainer® Blood Collection Tubes, Becton Dickinson, Franklin Lakes, EUA) e enviadas ao Translational Pathology Laboratory. A fração plasmática será separada das células sanguíneas por duas rodadas consecutivas de centrifugação por 30 min em temperatura ambiente a 1600 × g. O plasma coletado foi aliquotado e armazenado a -80 °C até o uso. O cfDNA é extraído de volumes de plasma variando de 0,4 a 5,5 ml usando o kit MagMax Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. A quantidade de cfDNA foi avaliada com o kit de ensaio dsDNA HS pelo Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific). A qualidade do cfDNA foi avaliada com o Agilent Tap Station System (Agilent Technologies, Santa Clara, EUA). Apenas amostras de cfDNA com um pico de tamanho de fragmento claro entre 140-200 pb serão consideradas para análise.

Preparação da biblioteca NGS As bibliotecas NGS serão preparadas a partir de 10 ng de cfDNA seguindo o Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay (Thermo Fisher Scientific). Nosso protocolo geral de preparação de biblioteca é baseado em uma reação de PCR touch-down multiplex de dois ciclos com uma faixa de temperatura de 64 °C a 58 °C, que permitiu amplificar regiões-alvo e introduzir identificadores moleculares exclusivos. Os amplicons marcados resultantes de cerca de 100-140 pb de comprimento são então limpos usando Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, EUA) em uma proporção de grânulo para amostra de 1,5 × e os produtos purificados são eluídos em 24 μl de tampão baixo TE. Uma segunda rodada de PCR (18 ciclos) será realizada em um volume total de 50 μl para amplificar os amplicons purificados e introduzir adaptadores Ion Torrent™ Tag-Sequencing contendo códigos de barras específicos da amostra. A biblioteca resultante de fragmentos de DNA-alvo será purificada por meio de uma limpeza em duas etapas usando Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) em uma relação pérola/amostra de 1,15× e 1,0×, respectivamente. As bibliotecas purificadas são então diluídas 1:1000 e quantificadas por qPCR usando o kit de quantificação universal de íons (Thermo Fisher Scientific). As bibliotecas de estoque quantificadas são então diluídas a 100 pM para a preparação do modelo a jusante.

Sequenciamento As bibliotecas NGS serão sequenciadas em um instrumento Ion S5™ (Thermo Fisher Scientific) usando tecnologia de sequenciamento de semicondutores. Resumidamente, as execuções de sequenciamento são planejadas no Torrent Suite Software™ v5.10, as bibliotecas são agrupadas e carregadas em um chip Ion 540™ usando o instrumento Ion Chef™ (Thermo Fisher Scientific). O chip carregado é então sequenciado usando 500 fluxos. Os dados brutos são processados ​​automaticamente no Torrent Server™ e alinhados ao genoma hg19 de referência. O QC será realizado manualmente para cada amostra com base nas seguintes métricas; número de leituras por amostra>15.000.000 (para bibliotecas Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay aries), leituras no alvo >90%, uniformidade de leitura >90%, cobertura molecular mediana >500×, cobertura mediana de leitura >15.000. As bibliotecas Tissue NGS são sequenciadas de acordo com as instruções do fabricante. Os dados de sequenciamento das amostras de passagem QC são então carregados no formato BAM para o Ion Reporter™ Analysis Server para chamada e anotação de variantes.

Análise de dados Para amostras de plasma, a chamada de variantes é realizada no software de análise Ion Reporter™ (IR) v5.10 usando os fluxos de trabalho Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0. O pipeline de análise também inclui processamento de sinal, chamada de base, atribuição de pontuação de qualidade, ajuste de adaptador, remoção de duplicatas de PCR e controle de qualidade de mapeamento. As métricas de cobertura para cada amplicon são obtidas executando o software Coverage Analysis Plugin v5.6 (Thermo Fisher Scientific). As variantes identificadas são consideradas apenas se a variante tiver uma cobertura molecular de pelo menos três, indicando que a variante é detectada em três moléculas modelo independentes. Finalmente, todas as mutações candidatas são revisadas manualmente usando o Integrative Genomics Viewer. Anotações adicionais serão realizadas pela plataforma Qiagen QCI e pelo sistema oLIMS interno.