En prospektiv undersøgelse med anvendelse af cirkulerende cellefrit DNA (cfDNA) til påvisning af RAS-mutationer hos patienter med avanceret kolorektal cancer.

Kolorektal cancer er fortsat den hyppigste kræftform blandt mænd og den tredje hyppigste blandt kvinder i Saudi-Arabien. Præsentation med metastatisk sygdom forekommer hos næsten en tredjedel af patienterne, hvor 5-års overlevelse falder signifikant fra 90 % i stadium 1 til 14 %, når sygdommen er metastatisk. Der er entusiasme i potentialet for flydende biopsier til at give let tilgængelige genetiske biomarkører til karakterisering af mutationskræft. Epidermal vækstfaktorreceptor (EGFR) monoklonale antistoffer anvendes i vid udstrækning til behandling af fremskreden kolorektal cancer, som ikke rummer RAS-mutationer (RAS-vildtype). Genotypebestemmelse af onkogene RAS-mutationer er derfor væsentlig at udføre før påbegyndelse af systemisk terapi for sådanne patienter, da tilstedeværelsen af ​​disse mutationer forudsiger resistens over for EGFR-målrettede antistoffer såsom cetuximab og panitumumab. Behandling af metastatisk CRC er blevet mere kompleks, og præcisionsmedicinske tilgange har udviklet sig i de senere år med opdagelsen af ​​nye onkogene (potentielt målrettede) veje. Prognosen for metastatisk kolorektal cancer er forbedret fra 6 måneder med den bedste støttende behandling til mere end 2 år med multi-agent kemo og målrettet behandling inklusive anti-EGFR-antistoffer. Målretning af andre enkeltveje i CRC, såsom tilføjelse af vaskulære endotelvækstfaktorhæmmere, har også gavnet patienterne. Det anslås, at 55 % af patienter med metastatisk kolorektal cancer (mCRC) vil have onkogene mutationer i KRAS og NRAS. Påvisning af sådanne mutationer er blevet foretaget på vævsbiopsier med den ulempe, at dette er en invasiv procedure, og data, der tyder på, at en sådan test muligvis ikke afspejler den sande mutationsbyrde af sygdommen, da et enkelt vævsfragment kan være utilstrækkeligt til at afspejle intratumoral heterogenitet. Der er stigende beviser, der tyder på, at flydende biopsier eller blodbaseret mutationsprofilering kan give en mere omfattende molekylær profil af sygdommen og har fordelen af ​​at være minimalt invasiv. Serielle flydende biopsier kan fungere som et værktøj til at identificere rumlig og tidsmæssig heterogenitet, der forudsiger respons eller resistens over for målrettede midler, og kan kaste lys over fremkomsten (eller forsvinden) af specifikke mutationer, der potentielt kan være målrettet med nyere antikræftmidler. For at tage højde for denne molekylære heterogenitet bør de genomiske profiler af patienter med metastatisk kolorektal cancer undersøges på forskellige tidspunkter i løbet af behandlingen ved hjælp af flydende biopsi.

Der har været små undersøgelser, der undersøgte mekanismer for resistens over for anti-EGFR monoklonale antistoffer i mCRC ved hjælp af flydende biopsi. En undersøgelse af 37 mCRC-patienter, der blev behandlet med cetuximab, fandt, at 40 % af dem udviklede RAS-mutationer ved progression 10). En anden undersøgelse med begrænset antal deltagere undersøgte patienter med mCRC behandlet med panitumumab og fandt, at 9 ud af 24 patienter (38%) udviklede KRAS-mutationer på behandling som en mekanisme for erhvervet resistens over for anti-EGFR-terapi. Desuden brugte færre undersøgelser med et begrænset antal patienter flydende biopsi som en biomarkør, når de genudfordrede mCRC-patienter med EGFR monoklonale antistoffer. Størstedelen af ​​disse undersøgelser var retrospektive. Men et var det første prospektive forsøg og havde en lignende protokol til vores undersøgelse. Den inkluderede 28 patienter og rapporterede, at 52 % af disse patienter var RAS-vildtype ved re-challenge med cetuximab - når disse patienter blev eksponeret for og udviklede sig på cetuximab i første linje. Denne undersøgelse viste, at genudfordring med cetuximab signifikant forbedrede progressionsfri overlevelse, når RAS blev fundet at være vildtype på cirkulerende tumor-DNA(12). En af begrænsningerne ved denne undersøgelse var, at en enkelt flydende biopsiprøve blev udført (før genudfordring med cetuximab) og derfor ikke viser den forudsagte "switch" af RAS-målet, som efterforskerne planlægger at studere i vores forsøg. Desuden er en nyere undersøgelsesprotokol blevet offentliggjort hos BMC Cancer, hvor efterforskerne planlægger at studere 120 patienter og udføre flydende biopsianalyse hver 3. måned, mens patienterne er på førstelinje cetuximab. Dette er for at studere udviklingen af ​​RAS-målet, og for at korrelere dette med sygdomsrespons, samt hjælpe med at vejlede terapi med EGFR-hæmmere hos mCRC-patienter. Baseret på begrænsede data har de nuværende retningslinjer dog endnu ikke vedtaget testning ved hjælp af flydende biopsi og ved hjælp af denne strategi til at beslutte om genudfordring af anti EGFR-behandling i 3. linje indstilling eller ej, hvilket er spørgsmålet, som efterforskerne gerne vil besvare i denne undersøgelse.

Cirkulerende cellefrit DNA (cfDNA) består af små nukleinsyrefragmenter frigivet fra celler ved ruptur, nekrose eller apoptose, der stammer fra normale og afdøde celler, og bliver nu i stigende grad brugt til at påvise RAS (og andre) mutationer hos patienter med fremskreden kolorektal cancer. Der er nye beviser for, at G12C RAS-mutation kan målrettes med et nyt antikræftmiddel.

efterforskerne sigter mod at udføre cfDNA-testning på patienter med fremskreden kolorektal cancer, som ikke har nogen RAS-mutationer, dvs. vildtype (og dermed starte på EGFR-hæmmere - som er standardbehandling) før tredjelinjebehandling. Dette vil hjælpe den behandlende læge med at beslutte, om de skal give disse patienter med RAS wt-status et anti-EGFR monoklonalt antistof eller standard tredjelinjebehandling (Regorafenib eller TAS-102). Disse patienter vil blive indsamlet over en 18 måneders periode. cfDNA-testen ved anden progression (dvs. før tredjelinjes systemisk terapi) vil afgøre, om den undergruppe af patienter, der kan have udviklet RAS-mutation(er) efter progression til førstelinjebehandling (eller andre mutationer som resistensmekanisme) med anti- EGFR monoklonale antistoffer har ændret deres RAS-status og er blevet vildtype. Dette vil understøtte genudfordringen af ​​EGFR-hæmmere i tredje linje og har potentiale til at ændre retningslinjerne for behandling af kolorektal cancer. Efter dette vil den primære investigator beslutte, om den skal genudfordres med anti-EGFR-hæmmer. Efterforskerne sigter mod at studere 60 patienter i alt og have mindst 30 patienter i gruppen med genudsættelse (med anti-EGFR mAb).

Materialer og metoder

Patienterne vil få deres standardbehandling (SOC) biopsi af tumor/metastatisk sted for at bekræfte diagnosen og bestemme RAS-status. Når RAS vildtype og primær sygdom er venstresidet, vil disse patienter modtage standard kemoterapi (valg af FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI) med en anti-EGFR mAb (cetuximab eller panitumumab). Ved progression af sygdommen vil andenlinje systemisk kemoterapi +/- anti VEGF antistof blive givet i henhold til SOC. Ved anden progression vil patienter blive tilmeldt undersøgelsen i henhold til inklusionskriterier og samtykke, og en cfDNA-blodprøve vil blive udtaget, og RAS-status vil blive undersøgt. Hvis RAS er vildtype, vil investigator beslutte, om den skal genudfordres med et anti-EGFR-antistof (se undersøgelsesskema - figur 1) eller give SOC tredje linje kemoterapi (Regorafenib eller TAS-102).

Sygdomsvurderinger vil blive udført hver 8. - 12. uge i henhold til SOC ved hjælp af CT-scanninger og/eller MR, og vil blive rapporteret i henhold til RECIST-kriterier v1.1.

Metoder til cfDNA Next Generation Sequencing (NGS) fra CRC-patienter cfDNA-ekstraktion Blodprøver vil blive indsamlet i K2EDTA-rør (BD Vacutainer® Blood Collection Tubes, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) og sendt til Translational Pathology Laboratory. Plasmafraktionen vil blive adskilt fra blodcellerne ved to på hinanden følgende runder af centrifugering i 30 minutter ved stuetemperatur ved 1600 × g. Det opsamlede plasma blev alikvoteret og opbevaret ved -80°C indtil brug. cfDNA ekstraheres fra plasmavolumener i området fra 0,4 til 5,5 ml ved hjælp af MagMax Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) i henhold til producentens instruktioner. CfDNA-mængden blev vurderet med dsDNA HS-analysesættet ved hjælp af Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific). cfDNA-kvaliteten blev vurderet med Agilent Tap Station System (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Kun cfDNA-prøver med en klar fragmentstørrelsetop mellem 140-200 bp vil blive overvejet til analyse.

NGS-biblioteksforberedelse NGS-biblioteker fremstilles ud fra 10 ng cfDNA efter Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay (Thermo Fisher Scientific). Vores generelle biblioteksforberedelsesprotokol er baseret på en to-cyklus multiplex touch-down PCR-reaktion med et temperaturområde fra 64 °C til 58 °C, som gjorde det muligt at amplificere målområder og introducere unikke molekylære identifikatorer. De resulterende mærkede amplikoner med en længde på omkring 100-140 bp renses derefter ved hjælp af Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, USA) ved et perle-til-prøveforhold på 1,5 ×, og oprensede produkter elueres i 24 μl lav TE-buffer. En anden runde af PCR (18 cyklusser) vil blive udført i et samlet volumen på 50 μl for at amplificere de oprensede amplikoner og introducere Ion Torrent™ Tag-Sequencing-adaptere, der indeholder prøvespecifikke stregkoder. Det resulterende bibliotek af mål-DNA-fragmenter vil blive oprenset ved at udføre en to-trins oprydning ved hjælp af Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) ved et perle til prøve-forhold på henholdsvis 1,15× og 1,0×. De oprensede biblioteker fortyndes derefter 1:1000 og kvantificeres ved qPCR under anvendelse af Ion Universal Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific). De kvantificerede stambiblioteker fortyndes derefter til 100 pM til nedstrøms skabelonfremstilling.

Sekvenserings-NGS-biblioteker vil blive sekventeret på et Ion S5™-instrument (Thermo Fisher Scientific) ved hjælp af halvleder-sekventeringsteknologi. Kort fortalt er sekventeringskørsler planlagt på Torrent Suite Software™ v5.10, biblioteker samles og indlæses på en Ion 540™-chip ved hjælp af Ion Chef™-instrumentet (Thermo Fisher Scientific). Den indlæste chip sekventeres derefter ved hjælp af 500 flows. Rådata behandles automatisk på Torrent Server™ og justeres til reference hg19-genomet. QC vil blive udført manuelt for hver prøve baseret på følgende metrics; antal aflæsninger pr. prøve >15.000.000 (for Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay-biblioteker), on-target-læsninger >90 %, læseensartethed >90 %, median molekylær dækning >500×, median aflæst dækning >15.000. Vævs-NGS-biblioteker sekventeres derefter i henhold til producentens instruktioner. Sekvenseringsdataene for de QC-passerende prøver uploades derefter i BAM-format til Ion Reporter™ Analysis Server til variantopkald og annotering.

Dataanalyse For plasmaprøver udføres variantopkald på Ion Reporter™ (IR) analysesoftware v5.10 ved hjælp af Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0 arbejdsgange. Analysepipelinen omfatter også signalbehandling, basekald, tildeling af kvalitetsscore, trimning af adapter, fjernelse af PCR-dubletter og kontrol af kortlægningskvalitet. Dækningsmålinger for hvert amplikon opnås ved at køre Coverage Analysis Plugin-softwaren v5.6 (Thermo Fisher Scientific). Identificerede varianter tages kun i betragtning, hvis varianten havde en molekylær dækning på mindst tre, hvilket indikerer, at varianten er påvist i tre uafhængige skabelonmolekyler. Endelig gennemgås alle kandidatmutationer manuelt ved hjælp af Integrative Genomics Viewer. Yderligere annotering vil blive udført af Qiagen QCI platform og in-house oLIMS system.