Een prospectieve studie waarbij gebruik wordt gemaakt van circulerend celvrij DNA (cfDNA) bij de detectie van RAS-mutaties bij patiënten met vergevorderde colorectale kanker.

Colorectale kanker blijft de meest voorkomende vorm van kanker bij mannen en de derde meest voorkomende bij vrouwen in Saoedi-Arabië. Presentatie met gemetastaseerde ziekte komt voor bij bijna een derde van de patiënten, waarbij de 5-jaarsoverleving aanzienlijk afneemt van 90% in stadium 1 tot 14% zodra de ziekte is uitgezaaid. Er is enthousiasme over het potentieel van vloeibare biopsieën om gemakkelijk toegankelijke genetische biomarkers te bieden voor de karakterisering van mutatiekanker. Epidermale groeifactorreceptor (EGFR) monoklonale antilichamen worden veel gebruikt bij de behandeling van gevorderde colorectale kanker die geen RAS-mutaties herbergt (RAS wild type). Daarom is genotypering van oncogene RAS-mutaties van essentieel belang voorafgaand aan de start van systemische therapie voor dergelijke patiënten, aangezien de aanwezigheid van deze mutaties resistentie tegen op EGFR gerichte antilichamen, zoals cetuximab en panitumumab, voorspelt. De behandeling van gemetastaseerde CRC is complexer geworden en precisiegeneeskundige benaderingen zijn de afgelopen jaren geëvolueerd met de ontdekking van nieuwe oncogene (potentieel targetbare) routes. De prognose van uitgezaaide dikkedarmkanker is verbeterd van 6 maanden met de beste ondersteunende zorg tot meer dan 2 jaar met multi-agent chemo en gerichte therapie inclusief anti-EGFR-antilichamen. Het richten op andere uitsplitsingsroutes in CRC, zoals het toevoegen van vasculaire endotheliale groeifactorremmers, heeft ook voordelen opgeleverd voor patiënten. Geschat wordt dat 55% van de patiënten met gemetastaseerde colorectale kanker (mCRC) oncogene mutaties in KRAS en NRAS zal hebben. Detectie van dergelijke mutaties is gedaan op weefselbiopten met het nadeel dat dit een invasieve procedure is, en gegevens suggereren dat dergelijke testen mogelijk geen afspiegeling zijn van de werkelijke mutatielast van de ziekte, aangezien een enkel weefselfragment onvoldoende kan zijn om de intratumorale heterogeniteit. Er is steeds meer bewijs dat suggereert dat vloeibare biopsieën of op bloed gebaseerde mutatieprofilering een uitgebreider moleculair profiel van de ziekte kunnen bieden, en het voordeel hebben dat ze minimaal invasief zijn. Seriële vloeibare biopsieën kunnen fungeren als een hulpmiddel om ruimtelijke en temporele heterogeniteit te identificeren die de respons of resistentie tegen gerichte middelen voorspelt, en kunnen licht werpen op het ontstaan ​​(of verdwijnen) van specifieke mutaties die mogelijk het doelwit kunnen zijn van nieuwere antikankermiddelen. Om rekening te houden met deze moleculaire heterogeniteit, moeten de genomische profielen van patiënten met gemetastaseerde colorectale kanker op verschillende tijdstippen in de loop van de therapie worden onderzocht met behulp van vloeibare biopsie.

Er zijn kleine onderzoeken geweest die mechanismen van resistentie tegen monoklonale anti-EGFR-antilichamen in mCRC onderzochten met behulp van vloeibare biopsie. Uit een onderzoek onder 37 mCRC-patiënten die met cetuximab werden behandeld, bleek dat 40% van hen bij progressie RAS-mutaties ontwikkelde 10). Een andere studie met een beperkt aantal deelnemers onderzocht patiënten met mCRC die werden behandeld met panitumumab en ontdekte dat 9 van de 24 patiënten (38%) tijdens de behandeling KRAS-mutaties ontwikkelden als een mechanisme van verworven resistentie tegen anti-EGFR-therapie. Bovendien gebruikten minder onderzoeken met een beperkt aantal patiënten vloeibare biopsie als biomarker bij het opnieuw uitdagen van mCRC-patiënten met monoklonale EGFR-antilichamen. De meeste van deze onderzoeken waren retrospectief. Een daarvan was echter de eerste prospectieve studie en had een vergelijkbaar protocol als onze studie. Het omvatte 28 patiënten en rapporteerde dat 52% van deze patiënten RAS-wildtype was bij hernieuwde provocatie met cetuximab - wanneer deze patiënten werden blootgesteld aan cetuximab en progressie vertoonden op cetuximab in de eerstelijnssetting. Deze studie toonde aan dat hernieuwde provocatie met cetuximab de progressievrije overleving significant verbeterde wanneer RAS wildtype bleek te zijn op circulerend tumor-DNA(12). Een van de beperkingen van deze studie was dat er een enkel vloeibaar biopsiemonster werd uitgevoerd (voorafgaand aan de hernieuwde provocatie met cetuximab) en daarom niet de voorspelde "omschakeling" van het RAS-doel weergeeft, die de onderzoekers van plan zijn te bestuderen in onze studie. Bovendien is er een recenter studieprotocol gepubliceerd bij BMC Cancer, waar de onderzoekers van plan zijn om 120 patiënten te bestuderen en elke 3 maanden vloeibare biopsie-analyse uit te voeren terwijl patiënten eerstelijns cetuximab gebruiken. Dit is om de evolutie van het RAS-doelwit te bestuderen en dit te correleren met ziekterespons, en om de therapie met EGFR-remmers bij mCRC-patiënten te helpen begeleiden. Op basis van beperkte gegevens hebben de huidige richtlijnen het testen met vloeibare biopsie en het gebruik van deze strategie echter nog niet goedgekeurd om te beslissen of anti-EGFR-therapie al dan niet in de 3e lijnssetting moet worden getest, wat de vraag is die de onderzoekers in dit onderzoek willen beantwoorden.

Circulerend celvrij DNA (cfDNA) bestaat uit kleine nucleïnezuurfragmenten die uit cellen zijn vrijgemaakt door ruptuur, necrose of apoptose afkomstig van normale en overleden cellen, en wordt nu in toenemende mate gebruikt om RAS- (en andere) mutaties op te sporen bij patiënten met vergevorderde darmkanker. Er is nieuw bewijs dat de G12C RAS-mutatie het doelwit kan zijn van een nieuw middel tegen kanker.

de onderzoekers streven ernaar om cfDNA-testen uit te voeren op patiënten met vergevorderde colorectale kankers die geen RAS-mutaties hebben, d.w.z. wildtype (en dus beginnen met EGFR-remmers - wat de standaardbehandeling is) vóór derdelijnstherapie. Dit zal de behandelend arts helpen beslissen of deze patiënten met RAS wt-status een anti-EGFR monoklonaal antilichaam of standaard derdelijnstherapie (regorafenib of TAS-102) moeten krijgen. Deze patiënten worden verzameld over een periode van 18 maanden. De cfDNA-test bij tweede progressie (d.w.z. voorafgaand aan derdelijns systemische therapie) zal bepalen of de subgroep van patiënten die mogelijk RAS-mutatie(s) hebben ontwikkeld na progressie naar eerstelijnstherapie (of andere mutaties als resistentiemechanisme) met anti- EGFR monoklonale antilichamen zijn van RAS-status veranderd en wildtype geworden. Dit zal de hernieuwde provocatie van EGFR-remmers in de derdelijnsomgeving ondersteunen, en heeft het potentieel om de richtlijnen voor de behandeling van colorectale kanker te veranderen. Hierop zal de hoofdonderzoeker beslissen of hij opnieuw wordt blootgesteld aan een anti-EGFR-remmer. De onderzoekers streven ernaar om in totaal 60 patiënten te bestuderen en ten minste 30 patiënten in de rechallenge-groep (met anti-EGFR-mAb) te hebben.

Materialen en methodes

Patiënten zullen hun standaardzorgbiopsie (SOC) van de tumor/gemetastaseerde plaats ondergaan om de diagnose te bevestigen en de RAS-status te bepalen. Zodra RAS wildtype en primaire ziekte linkszijdig is, zullen deze patiënten standaard chemotherapie krijgen (keuze uit FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI) met een anti-EGFR mAb (cetuximab of panitumumab). Bij progressie van de ziekte zal tweedelijns systemische chemotherapie +/- anti-VEGF-antilichaam worden gegeven volgens de SOC. Bij de tweede progressie zullen patiënten worden opgenomen in de studie volgens de inclusiecriteria en toestemming, en zal een cfDNA-bloedtest worden afgenomen en zal de RAS-status worden onderzocht. Als RAS wildtype is, zal de onderzoeker beslissen of hij opnieuw wordt blootgesteld aan een anti-EGFR-antilichaam (zie onderzoeksschema - figuur 1), of SOC derdelijns chemotherapie geeft (regorafenib of TAS-102).

Ziektebeoordelingen zullen elke 8 - 12 weken worden uitgevoerd volgens de SOC met behulp van CT-scans en/of MRI, en zullen worden gerapporteerd volgens de RECIST-criteria v1.1.

Methoden voor cfDNA Next Generation Sequencing (NGS) van CRC-patiënten cfDNA-extractie Bloedmonsters zullen worden verzameld in K2EDTA-buisjes (BD Vacutainer®-bloedafnamebuisjes, Becton Dickinson, Franklin Lakes, VS) en naar het Translational Pathology Laboratory worden gestuurd. De plasmafractie wordt van de bloedcellen gescheiden door twee opeenvolgende centrifugeerronden gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur bij 1600 × g. Het verzamelde plasma werd in porties verdeeld en tot gebruik bij -80°C bewaard. cfDNA wordt geëxtraheerd uit plasmavolumes variërend van 0,4 tot 5,5 ml met behulp van de MagMax Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, VS) volgens de instructies van de fabrikant. De cfDNA-hoeveelheid werd beoordeeld met de dsDNA HS-assaykit door de Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific). cfDNA-kwaliteit werd beoordeeld met het Agilent Tap Station System (Agilent Technologies, Santa Clara, VS). Alleen cfDNA-monsters met een duidelijke fragmentgroottepiek tussen 140-200 bp komen in aanmerking voor analyse.

Voorbereiding NGS-bibliotheek NGS-bibliotheken worden bereid uit 10 ng cfDNA volgens de Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay (Thermo Fisher Scientific). Ons algemene voorbereidingsprotocol voor de bibliotheek is gebaseerd op een multiplex touch-down PCR-reactie met twee cycli met een temperatuurbereik van 64 °C tot 58 °C, waardoor doelgebieden konden worden versterkt en unieke moleculaire identifiers konden worden geïntroduceerd. De resulterende gelabelde amplicons met een lengte van ongeveer 100-140 bp worden vervolgens opgeschoond met behulp van Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, VS) bij een korrel tot monsterverhouding van 1,5 x en gezuiverde producten worden geëlueerd in 24 μl lage TE-buffer. Een tweede PCR-ronde (18 cycli) zal worden uitgevoerd in een totaal volume van 50 μl om de gezuiverde amplicons te amplificeren en Ion Torrent™ Tag-Sequencing-adapters met monsterspecifieke streepjescodes te introduceren. De resulterende bibliotheek van doelwit-DNA-fragmenten zal worden gezuiverd door een opruiming in twee stappen uit te voeren met behulp van Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) bij een korrel-tot-monsterverhouding van respectievelijk 1,15× en 1,0×. De gezuiverde bibliotheken werden vervolgens 1:1000 verdund en gekwantificeerd door qPCR met behulp van de Ion Universal Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific). De gekwantificeerde voorraadbibliotheken worden vervolgens verdund tot 100 pM voor stroomafwaartse matrijsbereiding.

Sequentiebepaling NGS-bibliotheken zullen worden gesequenced op een Ion S5™-instrument (Thermo Fisher Scientific) met behulp van halfgeleidersequencingtechnologie. In het kort, sequencing-runs zijn gepland op de Torrent Suite Software™ v5.10, bibliotheken worden samengevoegd en geladen op een Ion 540™-chip met behulp van het Ion Chef™-instrument (Thermo Fisher Scientific). De geladen chip wordt vervolgens gesequenced met behulp van 500 flows. Ruwe gegevens worden automatisch verwerkt op de Torrent Server™ en afgestemd op het referentie-hg19-genoom. QC wordt handmatig uitgevoerd voor elk monster op basis van de volgende statistieken; aantal aflezingen per monster >15.000.000 (voor Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay-bibliotheken is aries), on-target aflezingen >90%, afleesuniformiteit >90%, mediane moleculaire dekking >500×, mediane aflezingsdekking >15.000. Weefsel-NGS-bibliotheken worden vervolgens gesequenced volgens de instructies van de fabrikant. De sequentiëringsgegevens van de QC-doorgangsmonsters worden vervolgens in BAM-indeling geüpload naar de Ion Reporter™-analyseserver voor variantoproep en annotatie.

Gegevensanalyse Voor plasmamonsters wordt variantoproep uitgevoerd op Ion Reporter™ (IR) analysesoftware v5.10 met behulp van de Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0-workflows. De analysepijplijn omvat ook signaalverwerking, basisoproepen, toewijzing van kwaliteitsscores, adaptertrimming, verwijdering van PCR-duplicaten en controle van de kaartkwaliteit. Dekkingsstatistieken voor elk amplicon worden verkregen door de Coverage Analysis Plugin-software v5.6 (Thermo Fisher Scientific) uit te voeren. Geïdentificeerde varianten worden alleen in aanmerking genomen als de variant een moleculaire dekking van ten minste drie heeft, wat aangeeft dat de variant wordt gedetecteerd in drie onafhankelijke templatemoleculen. Ten slotte worden alle kandidaat-mutaties handmatig beoordeeld met behulp van de Integrative Genomics Viewer. Verdere annotatie zal worden uitgevoerd door het Qiagen QCI-platform en het interne oLIMS-systeem.