Uno studio prospettico che utilizza il DNA libero delle cellule circolanti (cfDNA) nel rilevamento delle mutazioni RAS nei pazienti con carcinoma colorettale avanzato.

Il cancro del colon-retto rimane il cancro più comune tra gli uomini e il terzo più comune tra le donne in Arabia Saudita. La presentazione con malattia metastatica si verifica in quasi un terzo dei pazienti, con una sopravvivenza a 5 anni che diminuisce significativamente dal 90% nello stadio 1 al 14% una volta che la malattia è metastatica. C'è entusiasmo nel potenziale delle biopsie liquide per fornire biomarcatori genetici facilmente accessibili per la caratterizzazione mutazionale del cancro. Gli anticorpi monoclonali del recettore del fattore di crescita epidermico (EGFR) sono ampiamente utilizzati nel trattamento del carcinoma colorettale avanzato che non presenta mutazioni RAS (RAS wild type). Pertanto, la genotipizzazione delle mutazioni RAS oncogeniche è essenziale prima dell'inizio della terapia sistemica per tali pazienti poiché la presenza di queste mutazioni è predittiva della resistenza agli anticorpi mirati all'EGFR come cetuximab e panitumumab . Il trattamento del CRC metastatico è diventato più complesso e gli approcci di medicina di precisione si sono evoluti negli ultimi anni con la scoperta di nuovi percorsi oncogeni (potenzialmente mirabili). La prognosi del carcinoma del colon-retto metastatico è migliorata da 6 mesi con la migliore terapia di supporto a più di 2 anni con chemio multi-agente e terapia mirata inclusi gli anticorpi anti EGFR. Mirare ad altri percorsi di singolarizzazione nel CRC, come l'aggiunta di inibitori del fattore di crescita dell'endotelio vascolare, ha anche giovato ai pazienti. Si stima che il 55% dei pazienti con carcinoma colorettale metastatico (mCRC) presenterà mutazioni oncogeniche in KRAS e NRAS. Il rilevamento di tali mutazioni è stato effettuato su biopsie tissutali con lo svantaggio di essere una procedura invasiva e i dati suggeriscono che tali test potrebbero non riflettere il vero carico mutazionale della malattia poiché un singolo frammento di tessuto potrebbe essere inadeguato a riflettere il eterogeneità intratumorale. Vi sono prove crescenti che suggeriscono che le biopsie liquide o il profilo mutazionale basato sul sangue possono fornire un profilo molecolare più completo della malattia e comportano il vantaggio di essere minimamente invasivi. Le biopsie liquide seriali possono fungere da strumento per identificare l'eterogeneità spaziale e temporale che prevede la risposta o la resistenza ad agenti mirati e possono far luce sull'emergenza (o scomparsa) di mutazioni specifiche che potrebbero essere potenzialmente mirate con nuovi agenti antitumorali. Per tenere conto di questa eterogeneità molecolare, i profili genomici dei pazienti con carcinoma colorettale metastatico dovrebbero essere esaminati in diversi momenti durante il corso della terapia utilizzando la biopsia liquida .

Ci sono stati piccoli studi che hanno esaminato i meccanismi di resistenza agli anticorpi monoclonali anti EGFR nel mCRC utilizzando la biopsia liquida. Uno studio su 37 pazienti con mCRC trattati con cetuximab ha rilevato che il 40% di loro ha sviluppato mutazioni RAS alla progressione 10). Un altro studio con un numero limitato di partecipanti ha esaminato pazienti con mCRC trattati con panitumumab e ha rilevato che 9 pazienti su 24 (38%) hanno sviluppato mutazioni KRAS durante il trattamento come meccanismo di resistenza acquisita alla terapia anti-EGFR. Inoltre, un minor numero di studi con un numero limitato di pazienti ha utilizzato la biopsia liquida come biomarcatore quando si trattava nuovamente di pazienti affetti da mCRC con anticorpi monoclonali EGFR. La maggior parte di questi studi era retrospettiva. Tuttavia, uno era il primo studio prospettico e aveva un protocollo simile al nostro studio. Ha incluso 28 pazienti e ha riferito che il 52% di questi pazienti era di tipo RAS selvatico al re-challenge con cetuximab - quando questi pazienti sono stati esposti a cetuximab e sono progrediti in prima linea. Questo studio ha dimostrato che il re-challenge con cetuximab ha migliorato significativamente la sopravvivenza libera da progressione quando RAS è risultato essere wild type sul DNA tumorale circolante(12). Uno dei limiti di questo studio era che era stato eseguito un singolo campione di biopsia liquida (prima del re-challenge con cetuximab) e quindi non mostrava il previsto "cambio" del target RAS, che i ricercatori intendono studiare nel nostro studio. Inoltre, un protocollo di studio più recente è stato pubblicato presso BMC Cancer in cui i ricercatori prevedono di studiare 120 pazienti ed eseguire analisi di biopsia liquida ogni 3 mesi mentre i pazienti sono in cetuximab di prima linea. Questo per studiare l'evoluzione del target RAS e per correlarlo con la risposta alla malattia, nonché per aiutare a guidare la terapia con inibitori dell'EGFR nei pazienti con mCRC. Tuttavia, sulla base di dati limitati, le attuali linee guida non hanno ancora adottato i test che utilizzano la biopsia liquida e l'utilizzo di questa strategia per decidere se riattivare o meno la terapia anti EGFR in un contesto di terza linea, che è la domanda a cui i ricercatori vorrebbero rispondere in questo studio.

Il DNA libero cellulare circolante (cfDNA) è costituito da piccoli frammenti di acido nucleico liberati dalle cellule per rottura, necrosi o apoptosi originati da cellule normali e decedute, ed è ora sempre più utilizzato per rilevare mutazioni RAS (e altre) in pazienti con tumori colorettali avanzati. Ci sono nuove prove che la mutazione G12C RAS ​​può essere bersagliata con un nuovo agente antitumorale .

i ricercatori mirano a eseguire il test del cfDNA su pazienti con tumori del colon-retto avanzati che non presentano mutazioni RAS, ovvero wild type (e quindi iniziano con inibitori dell'EGFR - che è il trattamento standard di cura) prima della terapia di terza linea. Ciò aiuterà il medico curante a decidere se somministrare a questi pazienti con stato RAS wt un anticorpo monoclonale anti-EGFR o una terapia standard di terza linea (Regorafenib o TAS-102). Questi pazienti saranno raccolti per un periodo di 18 mesi. Il test cfDNA alla seconda progressione (cioè prima della terapia sistemica di terza linea) determinerà se il sottogruppo di pazienti che potrebbero aver sviluppato una o più mutazioni RAS dopo la progressione alla terapia di prima linea (o altre mutazioni come meccanismo di resistenza) con anti- Gli anticorpi monoclonali EGFR hanno cambiato il loro stato RAS e sono diventati wild type. Ciò sosterrà la nuova sfida degli inibitori dell'EGFR nell'impostazione di terza linea e ha il potenziale per cambiare le linee guida per il trattamento del cancro del colon-retto. Su questo, il ricercatore principale deciderà se riprovare con l'inibitore anti EGFR. Gli investigatori mirano a studiare 60 pazienti in totale e avere almeno 30 pazienti nel gruppo di rechallenge (con mAb anti EGFR).

Materiali e metodi

I pazienti riceveranno la loro biopsia standard di cura (SOC) del sito tumorale/metastatico per confermare la diagnosi e determinare lo stato RAS. Una volta che il RAS wild type e la malattia primaria sono sul lato sinistro, questi pazienti riceveranno chemioterapia standard (a scelta tra FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI) con un mAb anti EGFR (cetuximab o panitumumab). Dopo la progressione della malattia, verrà somministrata chemioterapia sistemica di seconda linea +/- anticorpo anti VEGF come da SOC. Alla seconda progressione, i pazienti verranno arruolati nello studio secondo i criteri di inclusione e il consenso, verrà prelevato un esame del sangue cfDNA e verrà esaminato lo stato RAS. Se RAS è di tipo selvatico, lo sperimentatore deciderà se ripetere il trattamento con un anticorpo anti EGFR (vedere lo schema dello studio - figura 1) o somministrare la chemioterapia SOC di terza linea (Regorafenib o TAS-102).

Le valutazioni della malattia verranno effettuate ogni 8-12 settimane secondo il SOC utilizzando scansioni TC e/o risonanza magnetica e verranno riportate secondo i criteri RECIST v1.1.

Metodi per cfDNA Next Generation Sequencing (NGS) da pazienti con CRC Estrazione di cfDNA I campioni di sangue saranno raccolti in provette K2EDTA (BD Vacutainer® Blood Collection Tubes, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) e inviati al Translational Pathology Laboratory. La frazione plasmatica sarà separata dalle cellule del sangue mediante due cicli consecutivi di centrifugazione per 30 minuti a temperatura ambiente a 1600 × g. Il plasma raccolto è stato aliquotato e conservato a -80°C fino al momento dell'uso. Il cfDNA viene estratto da volumi plasmatici compresi tra 0,4 e 5,5 ml utilizzando il kit di isolamento dell'acido nucleico totale privo di cellule MagMax (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) secondo le istruzioni del produttore. La quantità di cfDNA è stata valutata con il kit di analisi dsDNA HS dal fluorometro Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific). La qualità del cfDNA è stata valutata con il sistema Agilent Tap Station (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Verranno presi in considerazione per l'analisi solo i campioni di cfDNA con un picco di dimensione del frammento chiaro compreso tra 140 e 200 bp.

Preparazione delle librerie NGS Le librerie NGS saranno preparate da 10 ng di cfDNA seguendo il test Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free (Thermo Fisher Scientific). Il nostro protocollo di preparazione della libreria generale si basa su una reazione PCR touch-down multiplex a due cicli con un intervallo di temperatura da 64 ° C a 58 ° C, che ha permesso di amplificare le regioni target e introdurre identificatori molecolari univoci. Gli ampliconi contrassegnati risultanti di circa 100-140 bp di lunghezza vengono quindi ripuliti utilizzando Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, USA) con un rapporto tallone/campione di 1,5 × e i prodotti purificati vengono eluiti in 24 μl di tampone TE basso. Verrà eseguito un secondo ciclo di PCR (18 cicli) in un volume totale di 50 μl per amplificare gli ampliconi purificati e introdurre gli adattatori di sequenziamento dei tag Ion Torrent ™ contenenti codici a barre specifici del campione. La libreria risultante di frammenti di DNA bersaglio sarà purificata eseguendo una purificazione in due fasi utilizzando Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) con un rapporto bead/campione di 1,15× e 1,0×, rispettivamente. Le librerie purificate vengono quindi diluite 1:1000 e quantificate mediante qPCR utilizzando lo Ion Universal Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific). Le librerie stock quantificate vengono quindi diluite a 100 pM per la preparazione del modello a valle.

Sequenziamento Le librerie NGS saranno sequenziate su uno strumento Ion S5™ (Thermo Fisher Scientific) utilizzando la tecnologia di sequenziamento dei semiconduttori. In breve, le corse di sequenziamento sono pianificate sul Torrent Suite Software™ v5.10, le librerie sono raggruppate in pool e caricate su un chip Ion 540™ utilizzando lo strumento Ion Chef™ (Thermo Fisher Scientific). Il chip caricato viene quindi sequenziato utilizzando 500 flussi. I dati grezzi vengono elaborati automaticamente sul Torrent Server™ e allineati al genoma hg19 di riferimento. Il controllo di qualità verrà eseguito manualmente per ciascun campione in base alle seguenti metriche; numero di letture per campione>15.000.000 (per Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay library aries), letture sul target >90%, uniformità di lettura >90%, copertura molecolare mediana >500×, copertura di letture mediana >15.000. Le librerie Tissue NGS vengono quindi sequenziate secondo le istruzioni del produttore. I dati di sequenziamento dei campioni sottoposti a QC vengono quindi caricati in formato BAM su Ion Reporter™ Analysis Server per l'identificazione e l'annotazione delle varianti.

Analisi dei dati Per i campioni di plasma, l'identificazione delle varianti viene eseguita su Ion Reporter™ (IR) Analysis Software v5.10 utilizzando i flussi di lavoro Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0. La pipeline di analisi include anche l'elaborazione del segnale, l'identificazione delle basi, l'assegnazione del punteggio di qualità, il taglio dell'adattatore, la rimozione dei duplicati PCR e il controllo della qualità della mappatura. Le metriche di copertura per ciascun amplicone si ottengono eseguendo il software Coverage Analysis Plugin v5.6 (Thermo Fisher Scientific). Le varianti identificate vengono prese in considerazione solo se la variante ha una copertura molecolare di almeno tre, indicando che la variante viene rilevata in tre molecole modello indipendenti. Infine, tutte le mutazioni candidate vengono esaminate manualmente utilizzando Integrative Genomics Viewer. Ulteriori annotazioni saranno eseguite dalla piattaforma Qiagen QCI e dal sistema oLIMS interno.