Un estudio prospectivo que utiliza el uso de ADN libre de células circulantes (cfDNA) en la detección de mutaciones RAS en pacientes con cáncer colorrectal avanzado.

El cáncer colorrectal sigue siendo el cáncer más común entre los hombres y el tercero más común entre las mujeres en Arabia Saudita. La presentación con enfermedad metastásica ocurre en casi un tercio de los pacientes, y la supervivencia a los 5 años disminuye significativamente del 90 % en el estadio 1 al 14 % una vez que la enfermedad es metastásica. Hay entusiasmo en el potencial de las biopsias líquidas para proporcionar biomarcadores genéticos fácilmente accesibles para la caracterización del cáncer mutacional. Los anticuerpos monoclonales del receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR) se usan ampliamente en el tratamiento del cáncer colorrectal avanzado que no alberga mutaciones RAS (RAS de tipo salvaje). Por lo tanto, es esencial realizar el genotipado de las mutaciones RAS oncogénicas antes del inicio de la terapia sistémica para estos pacientes, ya que la presencia de estas mutaciones predice la resistencia a los anticuerpos dirigidos contra el EGFR, como cetuximab y panitumumab. El tratamiento del CCR metastásico se ha vuelto más complejo y los enfoques de medicina de precisión han evolucionado en los últimos años con el descubrimiento de nuevas vías oncogénicas (potencialmente dirigidas). El pronóstico del cáncer colorrectal metastásico ha mejorado de 6 meses con la mejor atención de apoyo a más de 2 años con quimioterapia de múltiples agentes y terapia dirigida que incluye anticuerpos anti EGFR. Apuntar a otras vías de singularización en el CCR, como agregar inhibidores del factor de crecimiento endotelial vascular, también ha beneficiado a los pacientes. Se estima que el 55% de los pacientes con cáncer colorrectal metastásico (mCRC) tendrán mutaciones oncogénicas en KRAS y NRAS. La detección de tales mutaciones se ha realizado en biopsias de tejido con la desventaja de que se trata de un procedimiento invasivo, y los datos sugieren que tal prueba puede no reflejar la verdadera carga mutacional de la enfermedad, ya que un solo fragmento de tejido puede ser inadecuado para reflejar la heterogeneidad intratumoral. Cada vez hay más evidencia que sugiere que las biopsias líquidas o los perfiles mutacionales basados ​​en sangre pueden proporcionar un perfil molecular más completo de la enfermedad y tienen la ventaja de ser mínimamente invasivos. Las biopsias líquidas en serie pueden actuar como una herramienta para identificar la heterogeneidad espacial y temporal que predice la respuesta o la resistencia a los agentes específicos, y pueden arrojar luz sobre la aparición (o desaparición) de mutaciones específicas que pueden ser el objetivo de nuevos agentes anticancerígenos. Para tener en cuenta esta heterogeneidad molecular, los perfiles genómicos de los pacientes con cáncer colorrectal metastásico deben examinarse en diferentes momentos durante el curso de la terapia mediante biopsia líquida.

Se han realizado pequeños estudios que examinaron los mecanismos de resistencia a los anticuerpos monoclonales anti-EGFR en mCRC mediante biopsia líquida. Un estudio de 37 pacientes con mCRC que fueron tratados con cetuximab encontró que el 40% de ellos desarrollaron mutaciones RAS en la progresión 10). Otro estudio con un número limitado de participantes examinó pacientes con mCRC tratados con panitumumab y encontró que 9 de 24 pacientes (38 %) desarrollaron mutaciones de KRAS durante el tratamiento como un mecanismo de resistencia adquirida a la terapia anti EGFR. Además, menos estudios con un número limitado de pacientes utilizaron la biopsia líquida como biomarcador al volver a exponer a los pacientes con CCRm con anticuerpos monoclonales contra EGFR. La mayoría de estos estudios fueron retrospectivos. Sin embargo, uno fue el primer ensayo prospectivo y tenía un protocolo similar al de nuestro estudio. Incluyó a 28 pacientes e informó que el 52 % de estos pacientes tenían RAS de tipo salvaje en la nueva exposición a cetuximab, cuando estos pacientes estaban expuestos y progresaron con cetuximab en el entorno de primera línea. Este estudio mostró que la reexposición a cetuximab mejoró significativamente la supervivencia libre de progresión cuando se encontró que el RAS era de tipo salvaje en el ADN tumoral circulante(12). Una de las limitaciones de este estudio fue que se realizó una sola muestra de biopsia líquida (antes de volver a exponerlo a cetuximab) y, por lo tanto, no muestra el "cambio" previsto del objetivo RAS, que los investigadores planean estudiar en nuestro ensayo. Además, se ha publicado un protocolo de estudio más reciente en BMC Cancer en el que los investigadores planean estudiar a 120 pacientes y realizar análisis de biopsia líquida cada 3 meses mientras los pacientes reciben cetuximab de primera línea. Esto es para estudiar la evolución del objetivo RAS y correlacionarlo con la respuesta de la enfermedad, así como ayudar a guiar la terapia con inhibidores de EGFR en pacientes con mCRC. Sin embargo, en base a datos limitados, las pautas actuales aún no han adoptado las pruebas con biopsia líquida y el uso de esta estrategia para decidir si se debe volver o no a la terapia anti EGFR en el entorno de tercera línea, que es la pregunta que a los investigadores les gustaría responder en este estudio.

El ADN libre de células circulantes (cfDNA) consiste en pequeños fragmentos de ácido nucleico liberados de las células por ruptura, necrosis o apoptosis que se originan en células normales y muertas, y ahora se usa cada vez más para detectar mutaciones RAS (y otras) en pacientes con cánceres colorrectales avanzados. Hay nuevas pruebas de que la mutación G12C RAS ​​puede ser objeto de un nuevo agente anticancerígeno.

el objetivo de los investigadores es realizar pruebas de cfDNA en pacientes con cánceres colorrectales avanzados que no tienen mutaciones RAS, es decir, de tipo salvaje (y, por lo tanto, comienzan con inhibidores de EGFR, que es el tratamiento estándar) antes de la terapia de tercera línea. Esto ayudará al médico tratante a decidir si administrar a estos pacientes con estado RAS wt un anticuerpo monoclonal anti-EGFR o una terapia estándar de tercera línea (Regorafenib o TAS-102). Estos pacientes serán recolectados durante un período de 18 meses. La prueba de cfDNA en la segunda progresión (es decir, antes de la terapia sistémica de tercera línea) determinará si el subconjunto de pacientes que pueden haber desarrollado mutaciones RAS después de la progresión a la terapia de primera línea (u otras mutaciones como mecanismo de resistencia) con anti - Los anticuerpos monoclonales de EGFR cambiaron su estado RAS y se convirtieron en tipo salvaje. Esto respaldará el nuevo desafío de los inhibidores de EGFR en el entorno de tercera línea y tiene el potencial de cambiar las pautas de tratamiento del cáncer colorrectal. Tras esto, el investigador principal decidirá si se vuelve a provocar con el inhibidor anti-EGFR. El objetivo de los investigadores es estudiar a 60 pacientes en total y tener al menos 30 pacientes en el grupo de reexposición (con mAb anti EGFR).

Materiales y métodos

A los pacientes se les realizará una biopsia estándar de atención (SOC) del sitio del tumor/metastásico para confirmar el diagnóstico y determinar el estado de RAS. Una vez que se deja el tipo salvaje de RAS y la enfermedad primaria, estos pacientes recibirán quimioterapia estándar (opciones de FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI) con un mAb anti EGFR (cetuximab o panitumumab). Tras la progresión de la enfermedad, se administrará quimioterapia sistémica de segunda línea +/- anticuerpo anti VEGF según el SOC. Tras la segunda progresión, los pacientes se inscribirán en el estudio según los criterios de inclusión y el consentimiento, y se realizará un análisis de sangre de cfDNA y se examinará el estado de RAS. Si RAS es de tipo salvaje, entonces el investigador decidirá si volver a exponerlo con un anticuerpo anti EGFR (consulte el esquema del estudio, figura 1) o administrar quimioterapia de tercera línea SOC (Regorafenib o TAS-102).

Las evaluaciones de la enfermedad se realizarán cada 8 a 12 semanas según el SOC mediante tomografías computarizadas y/o resonancias magnéticas, y se informarán según los criterios RECIST v1.1.

Métodos para la secuenciación de próxima generación (NGS) de cfDNA de pacientes con CRC Extracción de cfDNA Las muestras de sangre se recolectarán en tubos K2EDTA (BD Vacutainer® Blood Collection Tubes, Becton Dickinson, Franklin Lakes, EE. UU.) y se enviarán al Laboratorio de Patología Traslacional. La fracción de plasma se separará de las células sanguíneas mediante dos rondas consecutivas de centrifugación durante 30 min a temperatura ambiente a 1600 × g. El plasma recogido se dividió en alícuotas y se almacenó a -80 °C hasta su uso. El cfDNA se extrae de volúmenes de plasma que oscilan entre 0,4 y 5,5 ml utilizando el kit de aislamiento de ácido nucleico total sin células MagMax (Thermo Fisher Scientific, Waltham, EE. UU.) según las instrucciones del fabricante. La cantidad de cfDNA se evaluó con el kit de ensayo dsDNA HS mediante el fluorómetro Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific). La calidad del cfDNA se evaluó con el Agilent Tap Station System (Agilent Technologies, Santa Clara, EE. UU.). Solo se considerarán para el análisis las muestras de cfDNA con un pico de tamaño de fragmento claro entre 140 y 200 pb.

Preparación de bibliotecas NGS Las bibliotecas NGS se prepararán a partir de 10 ng de cfDNA siguiendo el ensayo Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free (Thermo Fisher Scientific). Nuestro protocolo general de preparación de bibliotecas se basa en una reacción de PCR multiplex touch-down de dos ciclos con un rango de temperatura de 64 °C a 58 °C, lo que permitió amplificar las regiones objetivo e introducir identificadores moleculares únicos. Los amplicones etiquetados resultantes de alrededor de 100-140 pb de longitud se limpian luego con Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, EE. UU.) en una proporción de perlas a muestra de 1,5x y los productos purificados se eluyen en 24 μl de tampón TE bajo. Se realizará una segunda ronda de PCR (18 ciclos) en un volumen total de 50 μl para amplificar los amplicones purificados e introducir adaptadores de secuenciación de etiquetas Ion Torrent™ que contienen códigos de barras específicos de la muestra. La biblioteca resultante de fragmentos de ADN diana se purificará realizando una limpieza en dos pasos con Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) en una proporción de perla a muestra de 1,15x y 1,0x, respectivamente. A continuación, las bibliotecas purificadas se diluyeron 1:1000 y se cuantificaron mediante qPCR con el kit de cuantificación universal de iones (Thermo Fisher Scientific). Las bibliotecas de stock cuantificadas luego se diluyen a 100 pM para la preparación de la plantilla aguas abajo.

Las bibliotecas de NGS de secuenciación se secuenciarán en un instrumento Ion S5™ (Thermo Fisher Scientific) utilizando tecnología de secuenciación de semiconductores. Brevemente, las ejecuciones de secuenciación se planifican en Torrent Suite Software™ v5.10, las bibliotecas se agrupan y se cargan en un chip Ion 540™ utilizando el instrumento Ion Chef™ (Thermo Fisher Scientific). Luego, el chip cargado se secuencia utilizando 500 flujos. Los datos sin procesar se procesan automáticamente en Torrent Server™ y se alinean con el genoma hg19 de referencia. El control de calidad se realizará manualmente para cada muestra en función de las siguientes métricas; número de lecturas por muestra> 15 000 000 (para bibliotecas de ensayo Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay), lecturas en el objetivo> 90 %, uniformidad de lectura> 90 %, cobertura molecular mediana> 500 ×, cobertura de lectura mediana> 15 000. A continuación, se secuencian las bibliotecas de tejido NGS de acuerdo con las instrucciones del fabricante. A continuación, los datos de secuenciación de las muestras que pasan el control de calidad se cargan en formato BAM en el servidor de análisis Ion Reporter™ para la llamada y anotación de variantes.

Análisis de datos Para las muestras de plasma, la llamada de variantes se realiza en el software de análisis Ion Reporter™ (IR) v5.10 utilizando los flujos de trabajo Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0. La canalización de análisis también incluye procesamiento de señales, llamada de bases, asignación de puntuación de calidad, recorte de adaptadores, eliminación de duplicados de PCR y control de la calidad del mapeo. Las métricas de cobertura para cada amplicón se obtienen ejecutando el software Coverage Analysis Plugin v5.6 (Thermo Fisher Scientific). Las variantes identificadas solo se consideran si la variante tenía una cobertura molecular de al menos tres, lo que indica que la variante se detecta en tres moléculas molde independientes. Finalmente, todas las mutaciones candidatas se revisan manualmente utilizando Integrative Genomics Viewer. La plataforma Qiagen QCI y el sistema oLIMS interno realizarán más anotaciones.