En prospektiv studie med bruk av sirkulerende cellefritt DNA (cfDNA) ved påvisning av RAS-mutasjoner hos pasienter med avansert kolorektal kreft.

Kolorektal kreft er fortsatt den vanligste kreftformen blant menn, og den tredje vanligste blant kvinner i Saudi-Arabia. Presentasjon med metastatisk sykdom forekommer hos nesten en tredjedel av pasientene, med 5-års overlevelse som reduseres betydelig fra 90 % i stadium 1 til 14 % når sykdommen er metastatisk. Det er entusiasme i potensialet for flytende biopsier for å gi lett tilgjengelige genetiske biomarkører for mutasjonskreftkarakterisering. Epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) monoklonale antistoffer er mye brukt i behandlingen av avansert kolorektal kreft som ikke inneholder RAS-mutasjoner (RAS villtype). Genotyping av onkogene RAS-mutasjoner er derfor essensielt å gjøre før oppstart av systemisk terapi for slike pasienter, da tilstedeværelsen av disse mutasjonene forutsier resistens mot EGFR-målrettede antistoffer som cetuximab og panitumumab. Behandling av metastatisk CRC har blitt mer kompleks og presisjonsmedisinske tilnærminger har utviklet seg de siste årene med oppdagelsen av nye onkogene (potensielt målrettede) veier. Prognosen for metastatisk tykktarmskreft har forbedret seg fra 6 måneder med best støttende behandling til mer enn 2 år med multi-agent kjemoterapi og målrettet terapi inkludert anti-EGFR-antistoffer. Målretting mot andre enkeltveier i CRC som å legge til vaskulære endotelvekstfaktorhemmere har også vært til nytte for pasientene. Det anslås at 55 % av pasientene med metastatisk kolorektal kreft (mCRC) vil ha onkogene mutasjoner i KRAS og NRAS. Påvisning av slike mutasjoner har blitt gjort på vevsbiopsier med ulempen at dette er en invasiv prosedyre, og data som tyder på at slik testing kanskje ikke reflekterer den sanne mutasjonsbyrden til sykdommen siden et enkelt fragment av vev kan være utilstrekkelig til å gjenspeile intratumoral heterogenitet. Det er økende bevis som tyder på at flytende biopsier eller blodbasert mutasjonsprofilering kan gi en mer omfattende molekylær profil av sykdommen, og har fordelen av å være minimalt invasiv. Serielle flytende biopsier kan fungere som et verktøy for å identifisere romlig og tidsmessig heterogenitet som forutsier respons eller resistens mot målrettede midler, og kan kaste lys over fremveksten (eller forsvinningen) av spesifikke mutasjoner som potensielt kan være målrettet med nyere antikreftmidler. For å ta hensyn til denne molekylære heterogeniteten, bør de genomiske profilene til pasienter med metastatisk kolorektal kreft undersøkes på forskjellige tidspunkt i løpet av behandlingen ved bruk av flytende biopsi.

Det har vært små studier som undersøkte mekanismer for resistens mot anti-EGFR monoklonale antistoffer i mCRC ved bruk av flytende biopsi. En studie av 37 mCRC-pasienter som ble behandlet med cetuximab fant at 40 % av dem utviklet RAS-mutasjoner ved progresjon 10). En annen studie med begrenset antall deltakere undersøkte pasienter med mCRC behandlet med panitumumab og fant at 9 av 24 pasienter (38%) utviklet KRAS-mutasjoner på behandling som en mekanisme for ervervet resistens mot anti-EGFR-terapi. Videre brukte færre studier med begrenset antall pasienter flytende biopsi som en biomarkør ved re-utfordring av mCRC-pasienter med EGFR monoklonale antistoffer. De fleste av disse studiene var retrospektive. En var imidlertid den første prospektive studien og hadde en lignende protokoll som vår studie. Den inkluderte 28 pasienter og rapporterte at 52 % av disse pasientene var RAS-viltype ved re-challenge med cetuximab - når disse pasientene ble eksponert for og progredierte med cetuximab i førstelinjeinnstillingen. Denne studien viste at re-challenge med cetuximab signifikant forbedret progresjonsfri overlevelse når RAS ble funnet å være villtype på sirkulerende tumor-DNA(12). En av begrensningene i denne studien var at en enkelt flytende biopsiprøve ble utført (før re-utfordring med cetuximab) og viser derfor ikke den forutsagte "svitsjen" av RAS-målet, som etterforskerne planlegger å studere i vår studie. Videre har en nyere studieprotokoll blitt publisert ved BMC Cancer hvor etterforskerne planlegger å studere 120 pasienter og utføre flytende biopsianalyse hver 3. måned mens pasientene er på førstelinje cetuximab. Dette for å studere utviklingen av RAS-målet, og for å korrelere dette med sykdomsrespons, samt hjelpe til med å veilede terapi med EGFR-hemmere hos mCRC-pasienter. Basert på begrensede data har imidlertid gjeldende retningslinjer ennå ikke tatt i bruk testing ved bruk av flytende biopsi og bruk av denne strategien for å avgjøre om re-utfordring av anti-EGFR-behandling i 3. linje-innstilling eller ikke, som er spørsmålet etterforskerne ønsker å svare på i denne studien.

Sirkulerende cellefritt DNA (cfDNA) består av små nukleinsyrefragmenter frigjort fra celler ved ruptur, nekrose eller apoptose som stammer fra normale og avdøde celler, og brukes nå i økende grad til å oppdage RAS (og andre) mutasjoner hos pasienter med avansert kolorektal kreft. Det er nye bevis for at G12C RAS-mutasjon kan målrettes med et nytt antikreftmiddel.

etterforskerne tar sikte på å utføre cfDNA-testing på pasienter med avansert kolorektal kreft som ikke har noen RAS-mutasjoner, dvs. villtype (og dermed starte på EGFR-hemmere - som er standardbehandling) før tredjelinjebehandling. Dette vil hjelpe den behandlende legen med å bestemme om de skal gi disse pasientene med RAS wt-status et anti-EGFR monoklonalt antistoff eller standard tredjelinjebehandling (Regorafenib eller TAS-102). Disse pasientene vil bli hentet over en 18 måneders periode. cfDNA-testen ved andre progresjon (dvs. før tredjelinjesystemisk terapi) vil avgjøre om undergruppen av pasienter som kan ha utviklet RAS-mutasjon(er) etter progresjon til førstelinjebehandling (eller andre mutasjoner som en mekanisme for resistens) med anti- EGFR monoklonale antistoffer har byttet RAS-status og blitt villtype. Dette vil støtte re-utfordringen av EGFR-hemmere i tredje linje, og har potensial til å endre retningslinjene for kolorektal kreftbehandling. Etter dette vil hovedetterforskeren avgjøre om den skal utfordres på nytt med anti-EGFR-hemmer. Etterforskerne tar sikte på å studere totalt 60 pasienter og ha minst 30 pasienter i gruppen med gjenutsatt behandling (med anti EGFR mAb).

Materialer og metoder

Pasientene vil få sin standardbehandling (SOC) biopsi av tumor/metastatisk sted for å bekrefte diagnosen og bestemme RAS-status. Når RAS villtype og primær sykdom er venstresidig, vil disse pasientene motta standard kjemoterapi (valg av FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI) med en anti-EGFR mAb (cetuximab eller panitumumab). Ved progresjon av sykdom vil andrelinje systemisk kjemoterapi +/- anti VEGF-antistoff gis i henhold til SOC. Ved andre progresjon vil pasienter bli registrert i studien i henhold til inklusjonskriterier og samtykke, og en cfDNA-blodprøve vil bli tatt, og RAS-status vil bli undersøkt. Hvis RAS er villtype, vil etterforskeren bestemme om den skal utfordres på nytt med et anti-EGFR-antistoff (se studieskjema - figur 1), eller gi SOC tredjelinjekjemoterapi (Regorafenib eller TAS-102).

Sykdomsvurderinger vil bli gjort hver 8. - 12. uke i henhold til SOC ved bruk av CT-skanninger og/eller MR, og vil bli rapportert i henhold til RECIST-kriteriene v1.1.

Metoder for cfDNA Next Generation Sequencing (NGS) fra CRC-pasienter cfDNA-ekstraksjon Blodprøver vil bli samlet i K2EDTA-rør (BD Vacutainer® Blood Collection Tubes, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) og sendt til Translational Pathology Laboratory. Plasmafraksjonen vil bli separert fra blodcellene ved to påfølgende runder med sentrifugering i 30 minutter ved romtemperatur ved 1600 × g. Det oppsamlede plasmaet ble alikvotert og lagret ved -80 °C inntil bruk. cfDNA ekstraheres fra plasmavolumer fra 0,4 til 5,5 ml ved bruk av MagMax Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. cfDNA-mengden ble vurdert med dsDNA HS-analysesettet av Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific). cfDNA-kvaliteten ble vurdert med Agilent Tap Station System (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Kun cfDNA-prøver med en klar fragmentstørrelsestopp mellom 140-200 bp vil bli vurdert for analyse.

NGS-bibliotek forberedelse NGS-biblioteker vil tilberedes fra 10 ng cfDNA etter Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay (Thermo Fisher Scientific). Vår generelle bibliotekforberedelsesprotokoll er basert på en to-syklus multipleks touch-down PCR-reaksjon med et temperaturområde fra 64 °C til 58 °C, som tillot å forsterke målregioner og introdusere unike molekylære identifikatorer. De resulterende merkede amplikonene med en lengde på rundt 100-140 bp blir deretter ryddet opp ved hjelp av Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, USA) i et perle-til-prøveforhold på 1,5 × og rensede produkter elueres i 24 ul lav TE-buffer. En andre runde med PCR (18 sykluser) vil bli utført i et totalt volum på 50 μl for å forsterke de rensede amplikonene og introdusere Ion Torrent™ Tag-Sequencing-adaptere som inneholder prøvespesifikke strekkoder. Det resulterende biblioteket av mål-DNA-fragmenter vil bli renset ved å utføre en totrinns opprydding ved bruk av Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) i et perle-til-prøveforhold på henholdsvis 1,15× og 1,0×. De rensede bibliotekene ble deretter fortynnet 1:1000 og kvantifisert ved qPCR ved bruk av Ion Universal Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific). De kvantifiserte lagerbibliotekene blir deretter fortynnet til 100 pM for nedstrøms malfremstilling.

Sekvensering av NGS-biblioteker vil bli sekvensert på et Ion S5™-instrument (Thermo Fisher Scientific) ved bruk av halvledersekvenseringsteknologi. Kort sagt, sekvenseringskjøringer er planlagt på Torrent Suite Software™ v5.10, biblioteker samles og lastes på en Ion 540™-brikke ved hjelp av Ion Chef™-instrumentet (Thermo Fisher Scientific). Den lastede brikken blir deretter sekvensert ved å bruke 500 strømmer. Rådata behandles automatisk på Torrent Server™ og justeres til referanse-hg19-genomet. QC vil bli utført manuelt for hver prøve basert på følgende beregninger; antall avlesninger per prøve >15 000 000 (for Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay-biblioteker), avlesninger på mål >90 %, leseuniformitet >90 %, median molekylær dekning >500×, median avlest dekning >15 000. Vevs NGS-biblioteker sekvenseres deretter i henhold til produsentens instruksjoner. Sekvenseringsdataene for QC-bestått prøvene lastes deretter opp i BAM-format til Ion Reporter™ Analysis Server for variantanrop og merknader.

Dataanalyse For plasmaprøver utføres variantanrop på Ion Reporter™ (IR) analyseprogramvare v5.10 ved å bruke Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0 arbeidsflyter. Analyserørledningen inkluderer også signalbehandling, baseanrop, kvalitetspoengtilordning, adaptertrimming, fjerning av PCR duplikater og kontroll av kartkvalitet. Dekningsmålinger for hvert amplikon oppnås ved å kjøre Programvare for Coverage Analysis Plugin v5.6 (Thermo Fisher Scientific). Identifiserte varianter vurderes kun hvis varianten hadde en molekylær dekning på minst tre, noe som indikerer at varianten er påvist i tre uavhengige malmolekyler. Til slutt blir alle kandidatmutasjoner gjennomgått manuelt ved hjelp av Integrative Genomics Viewer. Ytterligere merknader vil bli utført av Qiagen QCI-plattformen og internt oLIMS-system.