Prospektív tanulmány a keringő sejtmentes DNS (cfDNS) felhasználásával a RAS-mutációk kimutatására előrehaladott vastag- és végbélrákban szenvedő betegeknél.

A vastag- és végbélrák továbbra is a leggyakoribb rák a férfiak körében, és a harmadik leggyakoribb a nők körében Szaúd-Arábiában. A metasztatikus betegség a betegek csaknem egyharmadánál fordul elő, és az 5 éves túlélés jelentősen csökken az 1. stádiumban mért 90%-ról 14%-ra, ha a betegség áttétessé válik. Lelkesedés mutatkozik az iránt, hogy a folyékony biopsziák könnyen hozzáférhető genetikai biomarkereket biztosítsanak a mutációs rák jellemzésére. Az epidermális növekedési faktor receptor (EGFR) monoklonális antitesteit széles körben használják olyan előrehaladott vastagbélrák kezelésében, amelyek nem tartalmaznak RAS mutációkat (RAS vad típus). Ezért az onkogén RAS mutációk genotipizálása elengedhetetlen az ilyen betegek szisztémás terápia megkezdése előtt, mivel ezeknek a mutációknak a jelenléte az EGFR célzott antitestekkel, például a cetuximabbal és a panitumumabbal szembeni rezisztenciát jelez előre. A metasztatikus CRC kezelése összetettebbé vált, és az elmúlt években új onkogén (potenciálisan megcélozható) utak felfedezésével a precíziós gyógyászati ​​megközelítések fejlődtek. Az áttétes vastag- és végbélrák prognózisa a legjobb szupportív kezelés mellett 6 hónapról több mint 2 évre több hatóanyagot tartalmazó kemoterápiával és célzott terápiával, beleértve az anti-EGFR antitesteket is, javult. A CRC-ben más egyedi útvonalak megcélzása, például vaszkuláris endothel növekedési faktor inhibitorok hozzáadása a betegek számára is előnyös volt. Becslések szerint a metasztatikus vastag- és végbélrákban (mCRC) szenvedő betegek 55%-ánál lesz onkogén mutáció a KRAS-ban és az NRAS-ban. Az ilyen mutációk kimutatását szöveti biopsziákon végezték, azzal a hátránnyal, hogy ez egy invazív eljárás, és az adatok arra utalnak, hogy az ilyen vizsgálatok nem feltétlenül tükrözik a betegség valódi mutációs terhét, mivel előfordulhat, hogy egyetlen szövettöredék sem elegendő a betegség tükrözésére. intratumorális heterogenitás. Egyre több bizonyíték utal arra, hogy a folyékony biopsziák vagy a vér alapú mutációs profilalkotás átfogóbb molekuláris profilt biztosít a betegségről, és azzal az előnnyel jár, hogy minimálisan invazív. A sorozatos folyékony biopsziák eszközként szolgálhatnak a térbeli és időbeli heterogenitás azonosítására, megjósolva a célzott szerekkel szembeni választ vagy rezisztenciát, és fényt deríthetnek olyan specifikus mutációk megjelenésére (vagy eltűnésére), amelyek potenciálisan az újabb rákellenes szerekkel célozhatók. Ennek a molekuláris heterogenitásnak a figyelembevétele érdekében a metasztatikus vastag- és végbélrákos betegek genomi profilját a terápia során különböző időpontokban folyadékbiopsziával kell megvizsgálni.

Voltak olyan kis tanulmányok, amelyek folyékony biopsziával vizsgálták az anti-EGFR monoklonális antitestekkel szembeni rezisztencia mechanizmusait mCRC-ben. Egy 37, cetuximabbal kezelt mCRC-beteg bevonásával végzett vizsgálat azt találta, hogy 40%-uknál RAS-mutációk alakultak ki a progresszió 10. szakaszában. Egy másik, korlátozott számú résztvevővel végzett vizsgálatban panitumumabbal kezelt mCRC-ben szenvedő betegeket vizsgáltak, és azt találták, hogy 24 betegből 9-nél (38%) alakult ki KRAS-mutáció a kezelés során, ami az anti EGFR-terápiával szembeni szerzett rezisztencia mechanizmusa. Ezen túlmenően kevesebb, korlátozott számú beteg bevonásával végzett vizsgálat használt folyékony biopsziát biomarkerként, amikor az mCRC-s betegeket EGFR monoklonális antitestekkel ismételten kihívták. E tanulmányok többsége retrospektív volt. Az egyik azonban az első prospektív vizsgálat volt, és a vizsgálatunkhoz hasonló protokoll volt. 28 beteget vont be, és arról számolt be, hogy ezeknek a betegeknek 52%-a RAS vadtípusú volt az újbóli cetuximab-kezelés során – amikor ezeket a betegeket cetuximabnak tették ki, és az első vonalbeli kezelés során progrediált. Ez a tanulmány kimutatta, hogy a cetuximabbal történő újbóli fertőzés jelentősen javította a progressziómentes túlélést, amikor a RAS-t vad típusúnak találták a keringő tumor DNS-en (12). Ennek a vizsgálatnak az egyik korlátja az volt, hogy egyetlen folyékony biopsziás mintát vettek (a cetuximabbal történő újbóli beadás előtt), és ezért nem jeleníti meg a RAS-célpont előre jelzett "váltását", amelyet a vizsgálók a kísérletünkben tanulmányozni kívánnak. Ezenkívül egy újabb vizsgálati protokollt tettek közzé a BMC Cancernél, amelyben a vizsgálók azt tervezik, hogy 120 beteget tanulmányoznak, és 3 havonta folyadékbiopsziás elemzést végeznek, miközben a betegek első vonalbeli cetuximabot kapnak. Ennek célja a RAS-célpont evolúciójának tanulmányozása, és ennek összefüggésbe hozása a betegségre adott válaszokkal, valamint segíti az EGFR-gátlókkal történő terápia irányítását mCRC-s betegekben. Korlátozott adatok alapján azonban a jelenlegi irányelvek még nem fogadták el a folyékony biopsziát használó tesztelést, és ezt a stratégiát annak eldöntésére, hogy az anti EGFR-terápia ismételt kihívást jelent-e a harmadik vonalban, vagy sem, erre a kérdésre szeretnének választ adni a kutatók ebben a tanulmányban.

A keringő sejtmentes DNS (cfDNS) kis nukleinsav-fragmensekből áll, amelyek törés, nekrózis vagy apoptózis útján szabadulnak fel a sejtekből, normál és elhalt sejtekből származnak, és egyre gyakrabban használják RAS (és egyéb) mutációk kimutatására előrehaladott vastag- és végbélrákban szenvedő betegeknél. Új bizonyítékok támasztják alá, hogy a G12C RAS ​​mutációt célba lehet venni egy új rákellenes szerrel.

A kutatók célja, hogy cfDNS-tesztet végezzenek olyan előrehaladott vastagbélrákban szenvedő betegeken, akiknek nincs RAS-mutációja, azaz vad típusú (és így EGFR-inhibitorokkal kezdődnek – ami a szokásos ápolási kezelés) a harmadik vonalbeli terápia előtt. Ez segít a kezelőorvosnak eldönteni, hogy ezeknek a RAS wt státuszú betegeknek anti-EGFR monoklonális antitestet vagy standard harmadik vonalbeli terápiát (Regorafenib vagy TAS-102) adjon-e. Ezeket a betegeket 18 hónapon keresztül gyűjtik össze. A cfDNS-teszt a második progressziónál (azaz a harmadik vonalbeli szisztémás terápia előtt) meghatározza, hogy azoknak a betegeknek az alcsoportja, akiknél RAS-mutáció(k) alakulhattak-e ki az első vonalbeli terápiára (vagy a rezisztencia mechanizmusaként egyéb mutációkra) való áttérés után anti- Az EGFR monoklonális antitestek megváltoztatták RAS-státuszukat, és vad típusúakká váltak. Ez támogatja az EGFR-inhibitorok újbóli kihívását a harmadik vonalban, és megváltoztathatja a vastag- és végbélrák kezelési irányelveit. Ezt követően az elvi vizsgálatot végző személy dönt arról, hogy ismételten beadja-e az anti EGFR inhibitort. A kutatók célja összesen 60 beteg tanulmányozása, és legalább 30 beteget kell bevonni az újrafertőzés (anti EGFR mAb) csoportba.

Anyagok és metódusok

A diagnózis megerősítéséhez és a RAS állapot meghatározásához a betegek standard ellátási (SOC) biopsziájukat végzik a tumor/metasztatikus helyről. Amint a RAS vad típusú, és az elsődleges betegség baloldali, ezek a betegek standard kemoterápiában részesülnek (a FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI választhatók) anti EGFR mAb-vel (cetuximab vagy panitumumab). A betegség előrehaladtával második vonalbeli szisztémás kemoterápia +/- anti VEGF antitest kerül beadásra az SOC szerint. A második progresszió után a betegeket bevonják a vizsgálatba a felvételi kritériumok és beleegyezésük szerint, és cfDNS vérvizsgálatot vesznek, és megvizsgálják a RAS állapotát. Ha a RAS vad típusú, akkor a vizsgáló dönti el, hogy újból ki kell-e provokálni egy anti EGFR antitestet (lásd a vizsgálati sémát – 1. ábra), vagy SOC harmadik vonalbeli kemoterápiát (Regorafenib vagy TAS-102) alkalmaz.

A betegségfelméréseket 8-12 hetente végzik el az SOC szerint CT-vizsgálatok és/vagy MRI segítségével, és jelentésük a RECIST v1.1-es kritériumai szerint történik.

A cfDNS Next Generation Sequencing (NGS) módszerei CRC-betegekből cfDNS-kivonás A vérmintákat K2EDTA-csövekbe gyűjtik (BD Vacutainer® Blood Collection Tubes, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA), és elküldik a Translational Pathology Laboratoryba. A plazmafrakciót két egymást követő centrifugálással választják el a vérsejtektől 30 percig szobahőmérsékleten 1600 × g-vel. Az összegyűjtött plazmát aliquot részekre osztjuk, és felhasználásig -80 °C-on tároljuk. A cfDNS-t 0,4 és 5,5 ml közötti plazmatérfogatból vonják ki a MagMax Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) segítségével a gyártó utasításai szerint. A cfDNS mennyiségét a dsDNA HS assay kittel határoztuk meg a Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) segítségével. A cfDNS minőségét az Agilent Tap Station System rendszerrel (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) értékelték. Csak a 140-200 bp közötti tiszta fragmentumméret-csúccsal rendelkező cfDNS-minták kerülnek elemzésre.

Az NGS-könyvtár előkészítése Az NGS-könyvtárakat 10 ng cfDNS-ből állítjuk elő az Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay-t (Thermo Fisher Scientific) követően. Általános könyvtár-előkészítési protokollunk egy kétciklusú multiplex touch-down PCR reakción alapul, 64 °C és 58 °C közötti hőmérséklet-tartományban, amely lehetővé tette a célrégiók felerősítését és egyedi molekuláris azonosítók bevezetését. A kapott, körülbelül 100-140 bp hosszúságú jelölt amplikonokat ezután Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, USA) segítségével 1,5-szeres gyöngy/minta arány mellett megtisztítják, és a tisztított termékeket 24 μl alacsony TE pufferben eluálják. A PCR második köre (18 ciklus) 50 μl össztérfogatban kerül végrehajtásra a tisztított amplikonok felerősítésére és a mintaspecifikus vonalkódokat tartalmazó Ion Torrent™ Tag-Sequencing adapterek bevezetésére. A cél-DNS-fragmensek így kapott könyvtárát Agencourt AMPure XP-vel (Beckman Coulter) kétlépéses tisztítással tisztítjuk, 1,15-szeres, illetve 1,0-szeres gyöngy/minta arány mellett. A tisztított könyvtárakat ezután 1:1000 arányban újrahígítottuk, és qPCR-rel mennyiségileg meghatároztuk az Ion Universal Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific) segítségével. A számszerűsített törzskönyvtárakat azután 100 pM-re hígítjuk a downstream templát elkészítéséhez.

Az NGS-könyvtárak szekvenálása egy Ion S5™ műszeren (Thermo Fisher Scientific) történik, félvezető szekvenálási technológia segítségével. Röviden, szekvenálási futtatásokat tervezünk a Torrent Suite Software™ v5.10-en, a könyvtárakat egyesítjük, és az Ion Chef™ eszközzel (Thermo Fisher Scientific) egy Ion 540™ chipre töltjük. A betöltött chipet ezután 500 áramlással szekvenáljuk. A nyers adatokat a Torrent Server™ automatikusan feldolgozza, és a referencia hg19 genomhoz igazítja. A minőségellenőrzést manuálisan hajtják végre minden egyes mintánál a következő mutatók alapján; mintánkénti leolvasások száma > 15 000 000 (az Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay könyvtárak esetében), a célérték > 90%, a leolvasási egyenletesség > 90%, a molekuláris lefedettség mediánja > 500×, az olvasási lefedettség mediánja >15 000. A szöveti NGS-könyvtárakat ezután a gyártó utasításai szerint szekvenálják. A QC átadott minták szekvenálási adatai ezután BAM formátumban feltöltésre kerülnek az Ion Reporter™ Analysis Server-re változathívás és annotálás céljából.

Adatelemzés A plazmaminták esetében a variánshívás az Ion Reporter™ (IR) Analysis Software v5.10-es verziójában történik az Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0 munkafolyamatokkal. Az elemzési folyamat magában foglalja a jelfeldolgozást, az alaphívást, a minőségi pontszámok hozzárendelését, az adapter trimmét, a PCR-másolat eltávolítását és a leképezés minőségének ellenőrzését. Az egyes amplikonok lefedettségi mutatói a Coverage Analysis Plugin v5.6 (Thermo Fisher Scientific) szoftver futtatásával érhetők el. Az azonosított változatokat csak akkor vesszük figyelembe, ha a variáns legalább három molekuláris lefedettséggel rendelkezik, ami azt jelzi, hogy a változat három független templátmolekulában mutatható ki. Végül az összes jelölt mutációt manuálisan ellenőrizzük az Integrative Genomics Viewer segítségével. A további megjegyzéseket a Qiagen QCI platform és a házon belüli oLIMS rendszer végzi.