Prospektivní studie využívající využití cirkulující bezbuněčné DNA (cfDNA) při detekci mutací RAS u pacientů s pokročilým kolorektálním karcinomem.

Rakovina tlustého střeva a konečníku zůstává nejčastější rakovinou u mužů a třetí nejčastější u žen v Saúdské Arábii. Prezentace s metastatickým onemocněním se vyskytuje u téměř jedné třetiny pacientů, přičemž 5leté přežití významně klesá z 90 % ve stadiu 1 na 14 %, jakmile je onemocnění metastatické. Potenciál tekutých biopsií poskytnout snadno dostupné genetické biomarkery pro charakterizaci mutační rakoviny je nadšený. Monoklonální protilátky receptoru epidermálního růstového faktoru (EGFR) jsou široce používány při léčbě pokročilého kolorektálního karcinomu, které nenesou mutace RAS (RAS divokého typu). Genotypizaci onkogenních mutací RAS je proto u takových pacientů nezbytné provést před zahájením systémové léčby, protože přítomnost těchto mutací předpovídá rezistenci na protilátky cílené na EGFR, jako je cetuximab a panitumumab. Léčba metastatického CRC se stala složitější a přístupy přesné medicíny se v posledních letech vyvinuly s objevem nových onkogenních (potenciálně cílených) cest. Prognóza metastazujícího kolorektálního karcinomu se zlepšila z 6 měsíců s nejlepší podpůrnou péčí na více než 2 roky s multiagentní chemoterapií a cílenou terapií včetně anti EGFR protilátek. Zacílení na další jednotlivé cesty u CRC, jako je přidání inhibitorů vaskulárního endoteliálního růstového faktoru, přineslo pacientům také prospěch. Odhaduje se, že 55 % pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem (mCRC) bude mít onkogenní mutace v KRAS a NRAS. Detekce takových mutací byla provedena na tkáňových biopsiích s nevýhodou, že se jedná o invazivní postup, a údaje naznačující, že takové testování nemusí odrážet skutečnou mutační zátěž onemocnění, protože jediný fragment tkáně může být nedostatečný, aby odrážel intratumorální heterogenita. Přibývá důkazů naznačujících, že tekuté biopsie nebo mutační profilování založené na krvi mohou poskytnout komplexnější molekulární profil onemocnění a mají výhodu v tom, že jsou minimálně invazivní. Sériové tekuté biopsie mohou fungovat jako nástroj k identifikaci prostorové a časové heterogenity předpovídající odezvu nebo rezistenci vůči cíleným agens a mohou vrhnout světlo na vznik (nebo vymizení) specifických mutací, které mohou být potenciálně cíleny novějšími protirakovinnými látkami. Pro zohlednění této molekulární heterogenity by měly být genomové profily pacientů s metastatickým kolorektálním karcinomem vyšetřeny v různých časových bodech v průběhu terapie pomocí tekuté biopsie.

Byly provedeny malé studie, které zkoumaly mechanismy rezistence na monoklonální protilátky proti EGFR u mCRC pomocí tekuté biopsie. Studie s 37 pacienty s mCRC, kteří byli léčeni cetuximabem, zjistila, že u 40 % z nich se vyvinuly mutace RAS při progresi 10). Další studie s omezeným počtem účastníků zkoumala pacienty s mCRC léčené panitumumabem a zjistila, že u 9 z 24 pacientů (38 %) se vyvinuly mutace KRAS při léčbě jako mechanismus získané rezistence na léčbu anti EGFR. Méně studií s omezeným počtem pacientů navíc použilo tekutou biopsii jako biomarker při opětovném podání monoklonálních protilátek proti EGFR u pacientů s mCRC. Většina těchto studií byla retrospektivní. Jedna byla však první prospektivní studií a měla podobný protokol jako naše studie. Zahrnoval 28 pacientů a uvedl, že 52 % těchto pacientů bylo RAS divokého typu při opětovné expozici cetuximabem – když byli tito pacienti vystaveni cetuximabu a progredovali na cetuximabu v nastavení první linie. Tato studie ukázala, že opětovné podání cetuximabu významně zlepšilo přežití bez progrese, když bylo zjištěno, že RAS je divoký typ na cirkulující nádorové DNA(12). Jedním z omezení této studie bylo, že byl proveden jediný vzorek tekuté biopsie (před opětovnou expozicí cetuximabem), a proto nevykazuje předpokládanou „přeměnu“ cíle RAS, kterou vyšetřovatelé plánují studovat v naší studii. Kromě toho byl na BMC Cancer zveřejněn novější protokol studie, kde výzkumníci plánují studovat 120 pacientů a provádět analýzu tekuté biopsie každé 3 měsíce, zatímco pacienti dostávají cetuximab první linie. Cílem je studovat vývoj cíle RAS a korelovat jej s odpovědí na onemocnění a také pomoci při léčbě pomocí inhibitorů EGFR u pacientů s mCRC. Na základě omezených údajů však současné pokyny dosud nepřijaly testování pomocí tekuté biopsie a pomocí této strategie k rozhodnutí o opětovném vystavení anti-EGFR terapii ve 3. linii nebo ne, což je otázka, na kterou by výzkumníci rádi v této studii odpověděli.

Cirkulující bezbuněčná DNA (cfDNA) se skládá z malých fragmentů nukleových kyselin uvolněných z buněk rupturou, nekrózou nebo apoptózou pocházejících z normálních a zemřelých buněk a nyní se stále více používá k detekci RAS (a dalších) mutací u pacientů s pokročilými kolorektálními karcinomy. Existují nové důkazy, že mutace G12C RAS ​​může být cílena pomocí nového protirakovinného činidla.

výzkumníci mají za cíl provést testování cfDNA u pacientů s pokročilým kolorektálním karcinomem, kteří nemají žádné mutace RAS, tj. divokého typu (a proto začínají s inhibitory EGFR - což je standardní léčba) před terapií třetí linií. To pomůže ošetřujícímu lékaři rozhodnout, zda těmto pacientům se statusem RAS wt podat monoklonální protilátku proti EGFR nebo standardní terapii třetí linie (Regorafenib nebo TAS-102). Tito pacienti budou shromažďováni po dobu 18 měsíců. Test cfDNA při druhé progresi (tj. před systémovou terapií třetí linie) určí, zda podskupina pacientů, u kterých se mohla vyvinout mutace (mutace) RAS po progresi na terapii první linie (nebo jiné mutace jako mechanismus rezistence) s anti- Monoklonální protilátky EGFR změnily svůj status RAS a staly se divokým typem. To podpoří opětovné nasazení inhibitorů EGFR ve třetí linii a má potenciál změnit pokyny pro léčbu kolorektálního karcinomu. Na základě toho hlavní zkoušející rozhodne, zda znovu podat anti-EGFR inhibitor. Výzkumníci si kladou za cíl studovat celkem 60 pacientů a mít alespoň 30 pacientů ve skupině s opětovnou expozicí (s anti EGFR mAb).

Materiály a metody

Pacientům bude provedena standardní péče (SOC) biopsie nádoru/metastatického místa k potvrzení diagnózy a určení stavu RAS. Jakmile bude RAS divokého typu a primární onemocnění levostranné, budou tito pacienti dostávat standardní chemoterapii (výběr z FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI) s anti EGFR mAb (cetuximab nebo panitumumab). Po progresi onemocnění bude podávána druhá linie systémové chemoterapie +/- anti VEGF protilátka podle SOC. Po druhé progresi budou pacienti zařazeni do studie podle zařazovacích kritérií a souhlasu a bude jim odebrán krevní test cfDNA a bude vyšetřen stav RAS. Pokud je RAS divokého typu, pak zkoušející rozhodne, zda znovu nasadit protilátku proti EGFR (viz schéma studie - obrázek 1), nebo podat chemoterapii třetí linie SOC (Regorafenib nebo TAS-102).

Hodnocení onemocnění se bude provádět každých 8–12 týdnů podle SOC pomocí CT skenů a/nebo MRI a bude hlášeno podle kritérií RECIST v1.1.

Metody cfDNA sekvenování nové generace (NGS) od pacientů s CRC extrakce cfDNA Vzorky krve budou odebrány do zkumavek K2EDTA (BD Vacutainer® Blood Collection Tubes, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) a odeslány do Laboratoře translační patologie. Frakce plazmy bude oddělena od krvinek dvěma po sobě jdoucími koly centrifugace po dobu 30 minut při pokojové teplotě při 1600 × g. Odebraná plazma byla rozdělena na alikvoty a skladována při -80 °C až do použití. cfDNA se extrahuje z objemů plazmy v rozmezí od 0,4 do 5,5 ml pomocí soupravy MagMax Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) podle pokynů výrobce. Množství cfDNA bylo hodnoceno pomocí testovací soupravy dsDNA HS pomocí Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific). Kvalita cfDNA byla hodnocena pomocí systému Agilent Tap Station System (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Pro analýzu budou brány v úvahu pouze vzorky cfDNA s jasným vrcholem velikosti fragmentu mezi 140-200 bp.

Příprava knihovny NGS Knihovny NGS se připraví z 10 ng cfDNA podle testu Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay (Thermo Fisher Scientific). Náš obecný protokol přípravy knihovny je založen na dvoucyklové multiplexní touch-down PCR reakci s teplotním rozsahem od 64 °C do 58 °C, což umožnilo amplifikovat cílové oblasti a zavést jedinečné molekulární identifikátory. Výsledné značené amplikony o délce přibližně 100-140 bp se poté vyčistí pomocí Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, USA) v poměru perliček ke vzorku 1,5× a purifikované produkty se eluují ve 24 ul pufru s nízkým obsahem TE. Druhé kolo PCR (18 cyklů) bude provedeno v celkovém objemu 50 μl pro amplifikaci purifikovaných amplikonů a zavedení adaptérů Ion Torrent™ Tag-Sequencing obsahujících čárové kódy specifické pro vzorky. Výsledná knihovna fragmentů cílové DNA bude purifikována provedením dvoukrokového čištění pomocí Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) při poměru kuliček ke vzorku 1,15× a 1,0×, v daném pořadí. Purifikované knihovny se pak znovu zředí 1:1000 a kvantifikují se pomocí qPCR s použitím Ion Universal Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific). Kvantifikované zásobní knihovny se poté zředí na 100 pM pro přípravu downstream templátu.

Sekvenování Knihovny NGS budou sekvenovány na přístroji Ion S5™ (Thermo Fisher Scientific) pomocí technologie polovodičového sekvenování. Stručně, běhy sekvenování jsou plánovány na Torrent Suite Software™ v5.10, knihovny jsou sdruženy a načteny na čip Ion 540™ pomocí nástroje Ion Chef™ (Thermo Fisher Scientific). Vložený čip je poté sekvenován pomocí 500 toků. Nezpracovaná data jsou zpracována automaticky na Torrent Server™ a zarovnána s referenčním genomem hg19. Kontrola kvality bude provedena ručně pro každý vzorek na základě následujících metrik; počet čtení na vzorek > 15 000 000 (pro knihovny testu Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay), naměřené hodnoty > 90 %, uniformita čtení > 90 %, střední molekulární pokrytí > 500×, střední pokrytí čtení > 15 000. Tkáňové NGS knihovny jsou poté sekvenovány podle pokynů výrobce. Sekvenační data vzorků procházejících kontrolou kvality jsou poté nahrána ve formátu BAM na analytický server Ion Reporter™ pro volání variant a anotaci.

Analýza dat Volání variant vzorků plazmy se provádí v softwaru Ion Reporter™ (IR) Analysis Software v5.10 pomocí pracovních postupů Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0. Analytický kanál také zahrnuje zpracování signálu, volání bází, přiřazení skóre kvality, oříznutí adaptéru, odstranění duplikátů PCR a kontrolu kvality mapování. Metriky pokrytí pro každý amplikon se získávají spuštěním softwaru Coverage Analysis Plugin v5.6 (Thermo Fisher Scientific). Identifikované varianty jsou zvažovány pouze v případě, že varianta měla molekulární pokrytí alespoň tři, což ukazuje, že varianta je detekována ve třech nezávislých templátových molekulách. Nakonec jsou všechny kandidátní mutace ručně zkontrolovány pomocí Integrative Genomics Viewer. Další anotace bude provedena platformou Qiagen QCI a interním systémem oLIMS.