Une étude prospective utilisant l'ADN circulant sans cellules (cfDNA) dans la détection des mutations RAS chez les patients atteints d'un cancer colorectal avancé.

Le cancer colorectal reste le cancer le plus fréquent chez les hommes et le troisième chez les femmes en Arabie saoudite. La présentation d'une maladie métastatique survient chez près d'un tiers des patients , la survie à 5 ans diminuant significativement de 90 % au stade 1 à 14 % une fois la maladie métastatique . Le potentiel des biopsies liquides pour fournir des biomarqueurs génétiques facilement accessibles pour la caractérisation du cancer mutationnel suscite de l'enthousiasme. Les anticorps monoclonaux du récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) sont largement utilisés dans le traitement du cancer colorectal avancé qui n'héberge pas de mutations RAS (RAS sauvage). Par conséquent, le génotypage des mutations RAS oncogènes est essentiel avant le début du traitement systémique pour ces patients, car la présence de ces mutations prédit la résistance aux anticorps ciblés contre l'EGFR tels que le cétuximab et le panitumumab. Le traitement du CCR métastatique est devenu plus complexe et les approches de médecine de précision ont évolué ces dernières années avec la découverte de nouvelles voies oncogènes (potentiellement ciblables) . Le pronostic du cancer colorectal métastatique est passé de 6 mois avec les meilleurs soins de support à plus de 2 ans avec la polychimiothérapie et la thérapie ciblée incluant les anticorps anti-EGFR. Le ciblage d'autres voies de singularisation dans le CCR, comme l'ajout d'inhibiteurs du facteur de croissance de l'endothélium vasculaire, a également profité aux patients. On estime que 55 % des patients atteints d'un cancer colorectal métastatique (mCRC) auront des mutations oncogènes dans KRAS et NRAS. La détection de telles mutations a été effectuée sur des biopsies tissulaires avec l'inconvénient qu'il s'agit d'une procédure invasive, et des données suggérant que de tels tests peuvent ne pas refléter le véritable fardeau mutationnel de la maladie puisqu'un seul fragment de tissu peut être inadéquat pour refléter le hétérogénéité intratumorale. Il existe de plus en plus de preuves suggérant que les biopsies liquides ou le profilage mutationnel basé sur le sang peuvent fournir un profil moléculaire plus complet de la maladie et présentent l'avantage d'être peu invasifs. Les biopsies liquides en série peuvent servir d'outil pour identifier l'hétérogénéité spatiale et temporelle prédisant la réponse ou la résistance aux agents ciblés, et peuvent faire la lumière sur l'émergence (ou la disparition) de mutations spécifiques qui peuvent potentiellement être ciblées avec de nouveaux agents anticancéreux . Pour tenir compte de cette hétérogénéité moléculaire, les profils génomiques des patients atteints d'un cancer colorectal métastatique doivent être examinés à différents moments au cours du traitement par biopsie liquide.

Il y a eu de petites études qui ont examiné les mécanismes de résistance aux anticorps monoclonaux anti-EGFR dans le mCRC en utilisant la biopsie liquide. Une étude portant sur 37 patients atteints de CCRm traités par cetuximab a révélé que 40 % d'entre eux ont développé des mutations RAS à la progression 10). Une autre étude avec un nombre limité de participants a examiné des patients atteints de CCRm traités par panitumumab et a constaté que 9 patients sur 24 (38 %) ont développé des mutations de KRAS pendant le traitement en tant que mécanisme de résistance acquise au traitement anti-EGFR. En outre, moins d'études avec un nombre limité de patients ont utilisé la biopsie liquide comme biomarqueur lors de la ré-épreuve de patients atteints de CCRm avec des anticorps monoclonaux anti-EGFR. La majorité de ces études étaient rétrospectives. Cependant, l'un était le premier essai prospectif et avait un protocole similaire à notre étude. Elle incluait 28 patients et rapportait que 52 % de ces patients étaient de type sauvage RAS lors d'une nouvelle provocation avec le cétuximab - lorsque ces patients ont été exposés au cétuximab et ont progressé sous cetuximab dans le cadre de la première ligne. Cette étude a montré qu'une nouvelle provocation avec le cétuximab améliorait significativement la survie sans progression lorsque le RAS était de type sauvage sur l'ADN tumoral circulant (12). L'une des limites de cette étude était qu'un seul échantillon de biopsie liquide a été effectué (avant une nouvelle provocation avec le cétuximab) et n'affiche donc pas le « changement » prévu de la cible RAS, que les chercheurs prévoient d'étudier dans notre essai. De plus, un protocole d'étude plus récent a été publié chez BMC Cancer où les chercheurs prévoient d'étudier 120 patients et d'effectuer une analyse de biopsie liquide tous les 3 mois pendant que les patients sont sous cétuximab de première intention. Il s'agit d'étudier l'évolution de la cible RAS et de la corréler avec la réponse de la maladie, ainsi que d'aider à guider le traitement avec des inhibiteurs de l'EGFR chez les patients atteints de CCRm. Cependant, sur la base de données limitées, les directives actuelles n'ont pas encore adopté les tests utilisant la biopsie liquide et l'utilisation de cette stratégie pour décider de relancer ou non le traitement anti-EGFR en 3ème ligne, ce qui est la question à laquelle les chercheurs aimeraient répondre dans cette étude.

L'ADN acellulaire circulant (cfDNA) se compose de petits fragments d'acide nucléique libérés des cellules par rupture, nécrose ou apoptose provenant de cellules normales et décédées, et est maintenant de plus en plus utilisé pour détecter les mutations RAS (et autres) chez les patients atteints de cancers colorectaux avancés. Il existe de nouvelles preuves que la mutation G12C RAS ​​peut être ciblée avec un nouvel agent anticancéreux.

les chercheurs visent à effectuer des tests cfDNA sur des patients atteints de cancers colorectaux avancés qui n'ont pas de mutations RAS, c'est-à-dire de type sauvage (et donc commencent sur les inhibiteurs de l'EGFR - qui est le traitement standard de soins) avant le traitement de troisième ligne. Cela aidera le médecin traitant à décider s'il convient d'administrer à ces patients présentant un statut wt RAS un anticorps monoclonal anti-EGFR ou un traitement standard de troisième ligne (regorafenib ou TAS-102). Ces patients seront recueillis sur une période de 18 mois. Le test cfDNA lors de la deuxième progression (c. Les anticorps monoclonaux EGFR ont changé de statut RAS et sont devenus de type sauvage. Cela soutiendra la nouvelle provocation des inhibiteurs de l'EGFR dans le cadre de la troisième ligne et a le potentiel de modifier les directives de traitement du cancer colorectal. Sur ce, l'investigateur principal décidera s'il faut relancer le test avec un inhibiteur anti-EGFR. Les investigateurs ont pour objectif d'étudier 60 patients au total et d'avoir au moins 30 patients dans le groupe rechallenge (avec mAb anti-EGFR).

Matériels et méthodes

Les patients subiront leur biopsie standard de soins (SOC) du site tumoral / métastatique pour confirmer le diagnostic et déterminer le statut RAS. Une fois le RAS de type sauvage et la maladie primaire du côté gauche, ces patients recevront une chimiothérapie standard (choix de FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI) avec un mAb anti-EGFR (cetuximab ou panitumumab). Lors de la progression de la maladie, une chimiothérapie systémique de deuxième ligne +/- anticorps anti-VEGF sera administrée conformément à la SOC. Lors de la deuxième progression, les patients seront inscrits à l'étude conformément aux critères d'inclusion et au consentement, et un test sanguin cfDNA sera effectué et le statut RAS sera examiné. Si le RAS est de type sauvage, l'investigateur décidera s'il faut re-challenge avec un anticorps anti-EGFR (voir schéma de l'étude - figure 1), ou donner une chimiothérapie SOC de troisième ligne (Regorafenib ou TAS-102).

Des évaluations de la maladie seront effectuées toutes les 8 à 12 semaines conformément à la SOC à l'aide de tomodensitogrammes et/ou d'IRM, et seront rapportées conformément aux critères RECIST v1.1.

Méthodes de séquençage de nouvelle génération de cfDNA (NGS) à partir de patients CCR Extraction de cfDNA Des échantillons de sang seront prélevés dans des tubes K2EDTA (BD Vacutainer® Blood Collection Tubes, Becton Dickinson, Franklin Lakes, États-Unis) et envoyés au laboratoire de pathologie translationnelle. La fraction plasmatique sera séparée des cellules sanguines par deux tours consécutifs de centrifugation pendant 30 min à température ambiante à 1600 × g. Le plasma collecté a été aliquoté et stocké à -80°C jusqu'à utilisation. Le cfDNA est extrait de volumes de plasma allant de 0,4 à 5,5 ml à l'aide du kit d'isolement d'acide nucléique total sans cellule MagMax (Thermo Fisher Scientific, Waltham, États-Unis) conformément aux instructions du fabricant. La quantité de cfDNA a été évaluée avec le kit de dosage dsDNA HS par le fluoromètre Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific). La qualité du cfDNA a été évaluée avec le système Agilent Tap Station (Agilent Technologies, Santa Clara, États-Unis). Seuls les échantillons de cfDNA avec un pic de taille de fragment clair entre 140 et 200 bp seront pris en compte pour l'analyse.

Préparation de la bibliothèque NGS Les bibliothèques NGS seront préparées à partir de 10 ng de cfDNA après le test Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay (Thermo Fisher Scientific). Notre protocole général de préparation de bibliothèque est basé sur une réaction PCR multiplex touch-down à deux cycles avec une plage de température de 64 ° C à 58 ° C, ce qui a permis d'amplifier les régions cibles et d'introduire des identifiants moléculaires uniques. Les amplicons marqués résultants d'une longueur d'environ 100 à 140 pb sont ensuite nettoyés à l'aide d'Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, États-Unis) à un rapport bille / échantillon de 1,5 × et les produits purifiés sont élués dans 24 μl de tampon à faible TE. Un deuxième cycle de PCR (18 cycles) sera effectué dans un volume total de 50 μl pour amplifier les amplicons purifiés et introduire des adaptateurs Ion Torrent™ Tag-Sequencing contenant des codes-barres spécifiques à l'échantillon. La bibliothèque résultante de fragments d'ADN cibles sera purifiée en effectuant un nettoyage en deux étapes à l'aide d'Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) à un rapport billes/échantillon de 1,15× et 1,0×, respectivement. Les bibliothèques purifiées sont ensuite diluées au 1:1000 et quantifiées par qPCR à l'aide du kit Ion Universal Quantitation (Thermo Fisher Scientific). Les banques de stocks quantifiées sont ensuite diluées à 100 pM pour la préparation de la matrice en aval.

Séquençage Les bibliothèques NGS seront séquencées sur un instrument Ion S5™ (Thermo Fisher Scientific) en utilisant la technologie de séquençage des semi-conducteurs. En bref, des séquences de séquençage sont prévues sur le Torrent Suite Software™ v5.10, les bibliothèques sont regroupées et chargées sur une puce Ion 540™ à l'aide de l'instrument Ion Chef™ (Thermo Fisher Scientific). La puce chargée est ensuite séquencée en 500 flux. Les données brutes sont traitées automatiquement sur le Torrent Server™ et alignées sur le génome hg19 de référence. Le CQ sera effectué manuellement pour chaque échantillon en fonction des paramètres suivants ; nombre de lectures par échantillon > 15 000 000 (pour les bibliothèques de dosages sans cellules Oncomine™ Pan-Cancer aries), lectures ciblées > 90 %, uniformité de lecture > 90 %, couverture moléculaire médiane > 500×, couverture de lecture médiane > 15 000. Les bibliothèques tissulaires NGS sont ensuite séquencées selon les instructions du fabricant. Les données de séquençage des échantillons passant au CQ sont ensuite téléchargées au format BAM sur le serveur d'analyse Ion Reporter™ pour l'appel et l'annotation des variantes.

Analyse des données Pour les échantillons de plasma, l'appel des variantes est effectué sur le logiciel d'analyse Ion Reporter™ (IR) v5.10 à l'aide des flux de travail Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0. Le pipeline d'analyse comprend également le traitement du signal, l'appel de base, l'attribution du score de qualité, le découpage de l'adaptateur, la suppression des doublons PCR et le contrôle de la qualité du mappage. Les métriques de couverture pour chaque amplicon sont obtenues en exécutant le logiciel Coverage Analysis Plugin v5.6 (Thermo Fisher Scientific). Les variants identifiés ne sont pris en compte que si le variant avait une couverture moléculaire d'au moins trois, indiquant que le variant est détecté dans trois molécules matrices indépendantes. Enfin, toutes les mutations candidates sont examinées manuellement à l'aide de l'Integrative Genomics Viewer. Une annotation supplémentaire sera effectuée par la plate-forme Qiagen QCI et le système oLIMS interne.