Prospektywne badanie wykorzystujące krążące wolne DNA (cfDNA) w wykrywaniu mutacji RAS u pacjentów z zaawansowanym rakiem jelita grubego.

Rak jelita grubego pozostaje najczęstszym nowotworem wśród mężczyzn i trzecim co do częstości wśród kobiet w Arabii Saudyjskiej. Prezentacja z chorobą przerzutową występuje u prawie jednej trzeciej pacjentów, a 5-letnie przeżycie znacznie spada z 90% w stadium 1 do 14%, gdy choroba jest przerzutowa. Istnieje entuzjastyczny potencjał biopsji płynnych jako łatwo dostępnych biomarkerów genetycznych do charakteryzowania mutacji nowotworowych. Przeciwciała monoklonalne receptora naskórkowego czynnika wzrostu (EGFR) są szeroko stosowane w leczeniu zaawansowanego raka jelita grubego, który nie zawiera mutacji RAS (typu dzikiego RAS). Dlatego genotypowanie onkogennych mutacji RAS jest niezbędne przed rozpoczęciem leczenia ogólnoustrojowego u takich pacjentów, ponieważ obecność tych mutacji przewiduje oporność na przeciwciała skierowane przeciwko EGFR, takie jak cetuksymab i panitumumab. Leczenie przerzutowego CRC stało się bardziej złożone, a podejścia medycyny precyzyjnej ewoluowały w ostatnich latach wraz z odkryciem nowych szlaków onkogennych (potencjalnie możliwych do ukierunkowania). Rokowanie w raku jelita grubego z przerzutami poprawiło się z 6 miesięcy przy najlepszym leczeniu podtrzymującym do ponad 2 lat przy wielolekowej chemioterapii i terapii celowanej obejmującej przeciwciała anty-EGFR. Ukierunkowanie na inne szlaki wydzielania w CRC, takie jak dodanie inhibitorów czynnika wzrostu śródbłonka naczyniowego, również przyniosło korzyści pacjentom. Szacuje się, że 55% pacjentów z przerzutowym rakiem jelita grubego (mCRC) będzie miało mutacje onkogenne w genach KRAS i NRAS. Wykrywanie takich mutacji zostało wykonane na podstawie biopsji tkanek, z tą wadą, że jest to procedura inwazyjna, a dane sugerują, że takie badanie może nie odzwierciedlać prawdziwego obciążenia mutacyjnego chorobą, ponieważ pojedynczy fragment tkanki może być niewystarczający do odzwierciedlenia heterogeniczność wewnątrz guza. Istnieje coraz więcej dowodów sugerujących, że płynne biopsje lub profilowanie mutacji na podstawie krwi mogą zapewnić pełniejszy profil molekularny choroby i mają tę zaletę, że są minimalnie inwazyjne. Seryjne płynne biopsje mogą działać jako narzędzie do identyfikacji przestrzennej i czasowej heterogeniczności, przewidując odpowiedź lub oporność na celowane środki, i mogą rzucić światło na pojawienie się (lub zanik) określonych mutacji, które mogą być potencjalnie celem nowszych leków przeciwnowotworowych. Aby uwzględnić tę heterogeniczność molekularną, profile genomowe pacjentów z rakiem jelita grubego z przerzutami należy badać w różnych punktach czasowych w trakcie leczenia za pomocą płynnej biopsji.

Przeprowadzono niewielkie badania, w których zbadano mechanizmy oporności na przeciwciała monoklonalne anty-EGFR w mCRC przy użyciu płynnej biopsji. Badanie 37 pacjentów z mCRC, którzy byli leczeni cetuksymabem, wykazało, że u 40% z nich rozwinęły się mutacje RAS w fazie progresji 10). W innym badaniu z ograniczoną liczbą uczestników zbadano pacjentów z mCRC leczonych panitumumabem i stwierdzono, że u 9 z 24 pacjentów (38%) rozwinęły się mutacje KRAS podczas leczenia jako mechanizm nabytej oporności na terapię anty-EGFR. Ponadto w mniejszej liczbie badań z ograniczoną liczbą pacjentów wykorzystano płynną biopsję jako biomarker podczas ponownej prowokacji pacjentów z mCRC przeciwciałami monoklonalnymi EGFR. Większość z tych badań miała charakter retrospektywny. Jednak jedno było pierwszym prospektywnym badaniem i miało podobny protokół do naszego badania. Obejmowało ono 28 pacjentów i wykazało, że 52% z tych pacjentów miało RAS typu dzikiego podczas ponownej prowokacji cetuksymabem – kiedy ci pacjenci byli narażeni na cetuksymab i u których wystąpiła progresja w leczeniu pierwszego rzutu. Badanie to wykazało, że ponowna prowokacja cetuksymabem znacznie poprawiła przeżycie wolne od progresji, gdy stwierdzono, że RAS jest typu dzikiego w krążącym DNA nowotworu(12). Jednym z ograniczeń tego badania było to, że wykonano pojedynczą płynną próbkę biopsyjną (przed ponownym podaniem cetuksymabu), a zatem nie wykazano przewidywanej „zmiany” celu RAS, którą badacze planują zbadać w naszym badaniu. Ponadto w BMC Cancer opublikowano nowszy protokół badania, w którym badacze planują zbadać 120 pacjentów i przeprowadzać analizę płynnej biopsji co 3 miesiące, podczas gdy pacjenci otrzymują cetuksymab pierwszego rzutu. Ma to na celu zbadanie ewolucji celu RAS i skorelowanie tego z odpowiedzią na chorobę, a także pomoc w ukierunkowaniu terapii inhibitorami EGFR u pacjentów z mCRC. Jednakże, w oparciu o ograniczone dane, obecne wytyczne nie przyjęły jeszcze testów z użyciem płynnej biopsji i stosowania tej strategii do podejmowania decyzji o wznowieniu leczenia anty EGFR w ramach terapii 3. rzutu, na które badacze chcieliby odpowiedzieć w tym badaniu.

DNA wolne od krążących komórek (cfDNA) składa się z małych fragmentów kwasu nukleinowego uwolnionych z komórek w wyniku pęknięcia, martwicy lub apoptozy pochodzących z normalnych i martwych komórek i jest obecnie coraz częściej wykorzystywane do wykrywania mutacji RAS (i ​​innych) u pacjentów z zaawansowanym rakiem jelita grubego. Istnieją nowe dowody na to, że mutacja G12C RAS ​​może być celem nowego środka przeciwnowotworowego.

badacze dążą do wykonania badań cfDNA na pacjentach z zaawansowanym rakiem jelita grubego, którzy nie mają mutacji RAS, tj. typu dzikiego (i stąd rozpoczynają leczenie inhibitorami EGFR – co jest standardem leczenia) przed terapią trzeciej linii. Pomoże to lekarzowi prowadzącemu zdecydować, czy dać tym pacjentom ze statusem RAS wt przeciwciało monoklonalne anty-EGFR, czy standardową terapię trzeciego rzutu (Regorafenib lub TAS-102). Ci pacjenci będą zbierani przez okres 18 miesięcy. Test cfDNA w drugiej fazie progresji (tj. przed trzecią linią leczenia ogólnoustrojowego) określi, czy podgrupa pacjentów, u których mogły rozwinąć się mutacje RAS po progresji do pierwszej linii terapii (lub inne mutacje jako mechanizm oporności) z anty- Przeciwciała monoklonalne EGFR zmieniły swój status RAS i stały się typu dzikiego. Będzie to wspierać ponowną prowokację inhibitorami EGFR w ramach trzeciego rzutu i może potencjalnie zmienić wytyczne dotyczące leczenia raka jelita grubego. Na tej podstawie główny badacz zdecyduje, czy ponownie zastosować inhibitor anty-EGFR. Badacze mają na celu zbadanie łącznie 60 pacjentów i co najmniej 30 pacjentów w grupie ponownie prowokowanej (mAb anty EGFR).

Materiały i metody

Pacjenci zostaną poddani standardowej biopsji (SOC) guza/miejsca przerzutu w celu potwierdzenia diagnozy i określenia statusu RAS. Gdy RAS typu dzikiego i pierwotna choroba zostaną lewostronne, pacjenci ci otrzymają standardową chemioterapię (do wyboru FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI) z mAb anty EGFR (cetuksymab lub panitumumab). W przypadku progresji choroby zostanie podana chemioterapia ogólnoustrojowa drugiego rzutu +/- przeciwciało anty-VEGF zgodnie z SOC. Po drugiej progresji pacjenci zostaną włączeni do badania zgodnie z kryteriami włączenia i zgodą, zostanie pobrane badanie krwi cfDNA i zbadany zostanie status RAS. Jeśli RAS jest typu dzikiego, wówczas badacz zdecyduje, czy ponownie zastosować przeciwciało anty-EGFR (patrz schemat badania – ryc. 1), czy zastosować chemioterapię trzeciego rzutu SOC (Regorafenib lub TAS-102).

Oceny chorób będą przeprowadzane co 8–12 tygodni zgodnie z SOC przy użyciu tomografii komputerowej i/lub MRI i będą zgłaszane zgodnie z kryteriami RECIST v1.1.

Metody sekwencjonowania cfDNA nowej generacji (NGS) od pacjentów z CRC Ekstrakcja cfDNA Próbki krwi zostaną pobrane do probówek K2EDTA (probówki do pobierania krwi BD Vacutainer®, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) i przesłane do Laboratorium Patologii Translacyjnej. Frakcja osocza zostanie oddzielona od komórek krwi przez dwie kolejne rundy wirowania przez 30 min w temperaturze pokojowej przy 1600 x g. Zebrane osocze podzielono na porcje i przechowywano w temperaturze -80°C do czasu użycia. cfDNA jest ekstrahowany z objętości osocza w zakresie od 0,4 do 5,5 ml przy użyciu zestawu MagMax Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) zgodnie z instrukcjami producenta. Ilość cfDNA oceniono za pomocą zestawu testowego dsDNA HS za pomocą fluorometru Qubit 2.0 (Thermo Fisher Scientific). Jakość cfDNA oceniono za pomocą systemu Agilent Tap Station System (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Do analizy będą brane pod uwagę tylko próbki cfDNA z wyraźnym pikiem wielkości fragmentu między 140-200 bp.

Przygotowanie biblioteki NGS Biblioteki NGS zostaną przygotowane z 10 ng cfDNA po teście Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free (Thermo Fisher Scientific). Nasz ogólny protokół przygotowania biblioteki opiera się na dwucyklowej multipleksowej reakcji PCR typu touch-down w zakresie temperatur od 64 ° C do 58 ° C, co pozwoliło na amplifikację docelowych regionów i wprowadzenie unikalnych identyfikatorów molekularnych. Otrzymane znakowane amplikony o długości około 100-140 pz są następnie czyszczone przy użyciu Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, USA) przy stosunku kulek do próbki 1,5x i oczyszczone produkty eluuje się w 24 μl buforu o niskim TE. Druga runda PCR (18 cykli) zostanie przeprowadzona w całkowitej objętości 50 μl w celu amplifikacji oczyszczonych amplikonów i wprowadzenia adapterów Ion Torrent™ Tag-Sequencing zawierających kody kreskowe specyficzne dla próbki. Otrzymana biblioteka docelowych fragmentów DNA zostanie oczyszczona przez wykonanie dwuetapowego oczyszczania przy użyciu Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) przy stosunku perełek do próbki wynoszącym odpowiednio 1,15x i 1,0x. Oczyszczone biblioteki ponownie rozcieńczono 1:1000 i oznaczono ilościowo za pomocą qPCR przy użyciu Ion Universal Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific). Oznaczone ilościowo biblioteki podstawowe są następnie rozcieńczane do 100 pM w celu późniejszego przygotowania matrycy.

Sekwencjonowanie Biblioteki NGS będą sekwencjonowane na aparacie Ion S5™ (Thermo Fisher Scientific) przy użyciu technologii sekwencjonowania półprzewodników. W skrócie, przebiegi sekwencjonowania są planowane na oprogramowaniu Torrent Suite Software™ v5.10, biblioteki są łączone i ładowane na chipie Ion 540™ przy użyciu instrumentu Ion Chef™ (Thermo Fisher Scientific). Załadowany chip jest następnie sekwencjonowany przy użyciu 500 przepływów. Surowe dane są przetwarzane automatycznie na serwerze Torrent Server™ i dopasowywane do referencyjnego genomu hg19. Kontrola jakości zostanie przeprowadzona ręcznie dla każdej próbki w oparciu o następujące wskaźniki; liczba odczytów na próbkę >15 000 000 (dla bibliotek testu Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Aries), odczyty docelowe >90%, jednorodność odczytu >90%, mediana pokrycia molekularnego >500×, mediana pokrycia odczytu >15 000. Biblioteki tkanek NGS są następnie sekwencjonowane zgodnie z instrukcjami producenta. Dane sekwencjonowania próbek, które przeszły kontrolę jakości, są następnie przesyłane w formacie BAM do serwera analitycznego Ion Reporter™ Analysis Server w celu wywołania wariantów i adnotacji.

Analiza danych W przypadku próbek osocza wywoływanie wariantów przeprowadza się w oprogramowaniu analitycznym Ion Reporter™ (IR) Analysis Software v5.10 przy użyciu przepływów pracy Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0. Potok analizy obejmuje również przetwarzanie sygnału, wywoływanie zasad, przypisywanie wyniku jakości, przycinanie adaptera, usuwanie duplikatów PCR i kontrolę jakości mapowania. Metryki pokrycia dla każdego amplikonu uzyskuje się przez uruchomienie oprogramowania Coverage Analysis Plugin v5.6 (Thermo Fisher Scientific). Zidentyfikowane warianty są brane pod uwagę tylko wtedy, gdy wariant ma pokrycie molekularne co najmniej trzy, co wskazuje, że wariant jest wykrywany w trzech niezależnych cząsteczkach matrycowych. Wreszcie, wszystkie kandydujące mutacje są przeglądane ręcznie za pomocą przeglądarki Integrative Genomics Viewer. Dalsze adnotacje będą wykonywane przez platformę Qiagen QCI oraz wewnętrzny system oLIMS.