Tuleva tutkimus, jossa hyödynnetään kiertävän soluttoman DNA:n (cfDNA) käyttöä RAS-mutaatioiden havaitsemiseen potilailla, joilla on pitkälle edennyt kolorektaalisyöpä.

Kolorektaalisyöpä on edelleen miesten yleisin syöpä ja naisten kolmanneksi yleisin Saudi-Arabiassa. Metastaattista sairautta esiintyy lähes kolmanneksella potilaista, ja viiden vuoden eloonjäämisaika laskee merkittävästi 90 %:sta 1. vaiheessa 14 %:iin, kun tauti on metastaattinen. Nestemäisten biopsioiden mahdollisuus tarjota helposti saatavilla olevia geneettisiä biomarkkereita mutaatiosyövän karakterisointiin on innostunut. Epidermaalisen kasvutekijäreseptorin (EGFR) monoklonaalisia vasta-aineita käytetään laajalti edenneen paksusuolensyövän hoidossa, joissa ei ole RAS-mutaatioita (RAS-villityyppi). Tästä syystä onkogeenisten RAS-mutaatioiden genotyypitys on välttämätöntä ennen systeemisen hoidon aloittamista tällaisille potilaille, sillä näiden mutaatioiden esiintyminen ennustaa resistenssin EGFR:ään kohdistetuille vasta-aineille, kuten setuksimabille ja panitumumabille. Metastaattisen CRC:n hoidosta on tullut monimutkaisempaa, ja täsmälääketieteen lähestymistavat ovat kehittyneet viime vuosina, kun uusia onkogeenisiä (mahdollisesti kohdistettavia) reittejä on löydetty. Metastaattisen paksusuolensyövän ennuste on parantunut 6 kuukaudesta parhaalla tukihoidolla yli 2 vuoteen usean aineen kemoterapialla ja kohdistetulla hoidolla, mukaan lukien anti-EGFR-vasta-aineet. CRC:n muihin yksittäispolttoihin kohdistaminen, kuten verisuonten endoteelin kasvutekijän estäjien lisääminen, on hyödyttänyt myös potilaita. On arvioitu, että 55 %:lla potilaista, joilla on metastaattinen paksusuolensyöpä (mCRC), on onkogeenisiä mutaatioita KRAS:ssa ja NRAS:ssa. Tällaisten mutaatioiden havaitseminen on tehty kudosbiopsioista, ja sen haittapuolena on, että tämä menettely on invasiivinen, ja tiedot, jotka viittaavat siihen, että tällainen testaus ei välttämättä heijasta taudin todellista mutaatiotaakkaa, koska yksittäinen kudosfragmentti saattaa olla riittämätön kuvastamaan intratumoraalinen heterogeenisuus. On yhä enemmän todisteita, jotka viittaavat siihen, että nestemäiset biopsiat tai veripohjainen mutaatioprofilointi voivat tarjota kattavamman molekyyliprofiilin taudista ja että niiden etu on minimaalisesti invasiivinen. Sarjaiset nestemäiset biopsiat voivat toimia välineenä paikallisen ja ajallisen heterogeenisyyden tunnistamisessa, mikä ennustaa vastetta tai resistenssiä kohdennetuille aineille, ja ne voivat valaista spesifisten mutaatioiden ilmaantumista (tai katoamista), joihin voidaan mahdollisesti kohdistua uudempia syöpälääkkeitä. Tämän molekyylien heterogeenisyyden huomioon ottamiseksi metastaattisen paksusuolen ja peräsuolen syöpäpotilaiden genomiprofiilit tulee tutkia eri ajankohtina hoidon aikana nestebiopsialla.

On tehty pieniä tutkimuksia, joissa on tutkittu resistenssimekanismeja anti-EGFR-monoklonaalisille vasta-aineille mCRC:ssä käyttämällä nestemäistä biopsiaa. Tutkimuksessa 37 mCRC-potilaalla, joita hoidettiin setuksimabilla, havaittiin, että 40 %:lle heistä kehittyi RAS-mutaatioita etenemisvaiheessa 10). Toisessa tutkimuksessa, johon osallistui rajoitettu määrä osallistujia, tutkittiin panitumumabilla hoidettuja mCRC-potilaita ja havaittiin, että yhdeksälle 24 potilaasta (38 %) kehittyi KRAS-mutaatioita hoidon aikana hankitun resistenssin mekanismina anti-EGFR-hoidolle. Lisäksi harvemmissa tutkimuksissa rajoitetulla määrällä potilaita käytettiin nestemäistä biopsiaa biomarkkerina, kun mCRC-potilaita haastattiin uudelleen monoklonaalisilla EGFR-vasta-aineilla. Suurin osa näistä tutkimuksista oli retrospektiivisia. Yksi oli kuitenkin ensimmäinen mahdollinen tutkimus, ja sillä oli samanlainen protokolla kuin tutkimuksessamme. Se sisälsi 28 potilasta ja raportoi, että 52 % näistä potilaista oli RAS-villityyppiä, kun se altistettiin uudelleen setuksimabille – kun nämä potilaat altistettiin setuksimabille ja etenivät sen hoidossa ensimmäisen vaiheen aikana. Tämä tutkimus osoitti, että uudelleenaltistus setuksimabilla paransi merkittävästi etenemisvapaata eloonjäämistä, kun RAS:n havaittiin olevan villityyppinen kiertävässä kasvain-DNA:ssa (12). Yksi tämän tutkimuksen rajoituksista oli, että otettiin yksi nestemäinen biopsianäyte (ennen uudelleen altistamista setuksimabilla), joten se ei näytä ennustettua RAS-kohteen "vaihtoa", jota tutkijat aikovat tutkia tutkimuksessamme. Lisäksi BMC Cancerissa on julkaistu uudempi tutkimuspöytäkirja, jossa tutkijat suunnittelevat tutkivansa 120 potilasta ja suorittavansa nestebiopsia-analyysin kolmen kuukauden välein, kun potilaat saavat ensimmäisen linjan setuksimabia. Tämän tarkoituksena on tutkia RAS-kohteen kehitystä ja korreloida tämä sairauden vasteen kanssa sekä auttaa ohjaamaan EGFR-estäjien hoitoa mCRC-potilailla. Rajallisten tietojen perusteella nykyiset ohjeet eivät kuitenkaan ole vielä ottaneet käyttöön testausta, jossa käytetään nestebiopsiaa ja tätä strategiaa, jotta voidaan päättää, voidaanko anti-EGFR-hoito uudelleen altistaa 3. rivin asetukselle vai ei. Tähän kysymykseen tutkijat haluaisivat vastata tässä tutkimuksessa.

Kiertävä soluvapaa DNA (cfDNA) koostuu pienistä nukleiinihappofragmenteista, jotka vapautuvat soluista repeämisen, nekroosin tai apoptoosin seurauksena ja jotka ovat peräisin normaaleista ja kuolleista soluista, ja sitä käytetään nykyään yhä enemmän RAS- (ja muiden) mutaatioiden havaitsemiseen potilailla, joilla on pitkälle edennyt paksusuolen syöpä. On uutta näyttöä siitä, että G12C RAS ​​- mutaatio voidaan kohdistaa uudella syöpää estävällä aineella .

tutkijat pyrkivät suorittamaan cfDNA-testauksen potilaille, joilla on pitkälle edennyt paksusuolensyöpä ja joilla ei ole RAS-mutaatioita eli villityypin (ja siten EGFR-estäjillä - mikä on hoidon standardi) ennen kolmannen linjan hoitoa. Tämä auttaa hoitavaa lääkäriä päättämään, annetaanko näille potilaille, joilla on RAS wt -status, monoklonaalinen anti-EGFR-vasta-aine vai tavallinen kolmannen linjan hoito (regorafenibi tai TAS-102). Nämä potilaat kerätään 18 kuukauden aikana. cfDNA-testi toisessa etenemisvaiheessa (eli ennen kolmannen linjan systeemistä hoitoa) määrittää, onko potilaiden alaryhmälle, joille on saattanut kehittyä RAS-mutaatio(t) etenemisen jälkeen ensimmäisen linjan hoitoon (tai muita mutaatioita resistenssimekanismina) anti- EGFR-monoklonaaliset vasta-aineet ovat vaihtaneet RAS-statuksensa ja muuttuneet villityypeiksi. Tämä tukee EGFR-estäjien uudelleen haastamista kolmannen linjan asetuksissa ja saattaa muuttaa kolorektaalisyövän hoitoohjeita. Tämän jälkeen päätutkija päättää, altistetaanko se uudelleen anti-EGFR-estäjillä. Tutkijoiden tavoitteena on tutkia yhteensä 60 potilasta, ja vähintään 30 potilasta on uudelleenaltistusryhmässä (anti EGFR-mAb).

Materiaalit ja menetelmät

Potilaille tehdään normaalihoito (SOC) -biopsia kasvaimesta/metastaattisesta kohdasta diagnoosin vahvistamiseksi ja RAS-tilan määrittämiseksi. Kun RAS-villityyppi ja primaarinen sairaus on vasemmalla, nämä potilaat saavat tavanomaista kemoterapiaa (vaihtoehdot FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI) anti-EGFR-mAb:llä (setuksimabi tai panitumumabi). Taudin edetessä toisen linjan systeemistä kemoterapiaa +/- anti-VEGF-vasta-ainetta annetaan SOC:n mukaisesti. Toisen etenemisen jälkeen potilaat otetaan mukaan tutkimukseen mukaanottokriteerien ja suostumuksen mukaisesti, ja niistä otetaan cfDNA-veritesti ja RAS-tila tutkitaan. Jos RAS on villityyppinen, tutkija päättää, altistetaanko se uudelleen anti-EGFR-vasta-aineella (katso tutkimuskaavio – kuva 1) vai annetaanko SOC:n kolmannen rivin kemoterapiaa (Regorafenibi tai TAS-102).

Sairausarvioinnit tehdään 8–12 viikon välein SOC:n mukaan käyttäen TT-skannauksia ja/tai MRI:tä, ja ne raportoidaan RECIST-kriteerien v1.1 mukaisesti.

Menetelmät cfDNA Next Generation -sekvensointiin (NGS) CRC-potilailta cfDNA-uutto Verinäytteet kerätään K2EDTA-putkiin (BD Vacutainer® Blood Collection Tubes, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) ja lähetetään Translational Pathology Laboratorioon. Plasmafraktio erotetaan verisoluista kahdella peräkkäisellä sentrifugointikierroksella 30 minuutin ajan huoneenlämpötilassa 1600 x g:ssä. Kerätty plasma jaettiin eriin ja säilytettiin -80 °C:ssa käyttöön asti. cfDNA uutetaan 0,4 - 5,5 ml:n plasmatilavuuksista käyttämällä MagMax Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit -sarjaa (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) valmistajien ohjeiden mukaisesti. cfDNA-määrä arvioitiin dsDNA HS -määrityssarjalla Qubit 2.0 Fluorometer -laitteella (Thermo Fisher Scientific). cfDNA:n laatu arvioitiin Agilent Tap Station Systemillä (Agilent Technologies, Santa Clara, USA). Vain sellaiset cfDNA-näytteet, joiden fragmentin kokopiikki on välillä 140-200 bp, otetaan huomioon analysoinnissa.

NGS-kirjaston valmistus NGS-kirjastot valmistetaan 10 ng:sta cfDNA:ta Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay -testin (Thermo Fisher Scientific) jälkeen. Yleinen kirjaston valmistusprotokollamme perustuu kaksijaksoiseen multipleksiseen kosketus-PCR-reaktioon lämpötila-alueella 64 °C - 58 °C, mikä mahdollisti kohdealueiden vahvistamisen ja ainutlaatuisten molekyylitunnisteiden käyttöönoton. Tuloksena saadut, noin 100-140 bp:n pituiset leimatut amplikonit puhdistetaan sitten käyttämällä Agencourt AMPure XP:tä (Beckman Coulter, Brea, USA) helmi-näytesuhteella 1,5× ja puhdistetut tuotteet eluoidaan 24 µl:ssa matalan TE-puskuria. Toinen PCR-kierros (18 sykliä) suoritetaan 50 μl:n kokonaistilavuudella puhdistettujen amplikonien vahvistamiseksi ja näytekohtaisia ​​viivakoodeja sisältävien Ion Torrent™ Tag-Sequencing -adapterien käyttöönottamiseksi. Tuloksena oleva kohde-DNA-fragmenttien kirjasto puhdistetaan suorittamalla kaksivaiheinen puhdistus käyttäen Agencourt AMPure XP:tä (Beckman Coulter) helmen ja näytesuhteen ollessa 1,15x ja 1,0x, vastaavasti. Puhdistetut kirjastot laimennettiin sitten uudelleen suhteessa 1:1000 ja kvantifioitiin qPCR:llä käyttämällä Ion Universal Quantitation Kit -sarjaa (Thermo Fisher Scientific). Kvantifioidut varastokirjastot laimennetaan sitten 100 pM:iin alavirran templaatin valmistusta varten.

Sekvensointi NGS-kirjastot sekvensoidaan Ion S5™ -laitteella (Thermo Fisher Scientific) käyttämällä puolijohdesekvensointitekniikkaa. Lyhyesti sanottuna, sekvensointiajot suunnitellaan Torrent Suite Software™ v5.10:lle, kirjastot yhdistetään ja ladataan Ion 540™ -sirulle käyttämällä Ion Chef™ -laitetta (Thermo Fisher Scientific). Ladattu siru sekvensoidaan sitten käyttämällä 500 virtausta. Raakadata käsitellään automaattisesti Torrent Server™ -palvelimella ja kohdistetaan viite-hg19-genomiin. QC suoritetaan manuaalisesti jokaiselle näytteelle seuraavien mittareiden perusteella; lukujen määrä näytettä kohti > 15 000 000 (Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay -analyysikirjastoille aries), kohdelukemat > 90 %, lukeman tasaisuus > 90 %, molekyylikattavuuden mediaani > 500×, lukukattavuuden mediaani > 15 000. Kudos-NGS-kirjastot sekvensoidaan sitten valmistajan ohjeiden mukaisesti. QC:n läpäisevien näytteiden sekvensointitiedot ladataan sitten BAM-muodossa Ion Reporter™ Analysis Serverille varianttikutsua ja huomautuksia varten.

Tietojen analysointi Plasmanäytteille muunnelmien kutsuminen suoritetaan Ion Reporter™ (IR) Analysis Software v5.10 -analyysiohjelmistolla käyttämällä Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0 -työnkulkua. Analyysiputki sisältää myös signaalinkäsittelyn, peruskutsun, laatupisteiden määrittämisen, sovittimen trimmauksen, PCR-kopioiden poistamisen ja kartoituslaadun hallinnan. Kunkin amplikonin kattavuusmittarit saadaan suorittamalla Coverage Analysis Plugin -ohjelmisto v5.6 (Thermo Fisher Scientific). Tunnistetut variantit otetaan huomioon vain, jos variantin molekyylipeitto on vähintään kolme, mikä osoittaa, että variantti havaitaan kolmessa itsenäisessä templaattimolekyylissä. Lopuksi kaikki ehdokasmutaatiot tarkistetaan manuaalisesti käyttämällä Integrative Genomics Vieweria. Lisämerkinnät tekevät Qiagen QCI -alusta ja talon sisäinen oLIMS-järjestelmä.