Eine prospektive Studie zur Verwendung von zirkulierender zellfreier DNA (cfDNA) zum Nachweis von RAS-Mutationen bei Patienten mit fortgeschrittenem Darmkrebs.

Darmkrebs ist nach wie vor die häufigste Krebsart bei Männern und die dritthäufigste bei Frauen in Saudi-Arabien. Eine Präsentation mit metastasierter Erkrankung tritt bei fast einem Drittel der Patienten auf, wobei die 5-Jahres-Überlebensrate signifikant von 90 % im Stadium 1 auf 14 % abnimmt, sobald die Erkrankung metastasiert ist. Das Potenzial von Flüssigbiopsien , leicht zugängliche genetische Biomarker für die Charakterisierung von Mutationskrebs bereitzustellen , ist enthusiastisch . Monoklonale Antikörper gegen den epidermalen Wachstumsfaktorrezeptor (EGFR) werden häufig bei der Behandlung von fortgeschrittenem Darmkrebs eingesetzt, der keine RAS-Mutationen (RAS-Wildtyp) enthält. Daher ist die Genotypisierung von onkogenen RAS-Mutationen vor Beginn einer systemischen Therapie für solche Patienten unerlässlich, da das Vorhandensein dieser Mutationen eine Resistenz gegen EGFR-gerichtete Antikörper wie Cetuximab und Panitumumab vorhersagt. Die Behandlung von metastasiertem CRC ist komplexer geworden, und in den letzten Jahren haben sich mit der Entdeckung neuer onkogener (potenziell zielgerichteter) Signalwege Ansätze der Präzisionsmedizin entwickelt . Die Prognose von metastasiertem Darmkrebs hat sich von 6 Monaten mit bester unterstützender Behandlung auf mehr als 2 Jahre mit Chemotherapie mit mehreren Wirkstoffen und zielgerichteter Therapie, einschließlich Anti-EGFR-Antikörpern, verbessert . Die Ausrichtung auf andere vereinzelnde Signalwege bei Darmkrebs wie die Zugabe von Inhibitoren des vaskulären endothelialen Wachstumsfaktors hat den Patienten ebenfalls geholfen . Es wird geschätzt, dass 55 % der Patienten mit metastasiertem Darmkrebs (mCRC) onkogene Mutationen in KRAS und NRAS aufweisen. Der Nachweis solcher Mutationen wurde an Gewebebiopsien durchgeführt, mit dem Nachteil, dass es sich hierbei um ein invasives Verfahren handelt, und Daten deuten darauf hin, dass solche Tests möglicherweise nicht die wahre Mutationslast der Krankheit widerspiegeln, da ein einzelnes Gewebefragment möglicherweise nicht ausreicht, um dies widerzuspiegeln intratumorale Heterogenität. Es gibt zunehmend Hinweise darauf, dass Flüssigbiopsien oder blutbasierte Mutationsprofile ein umfassenderes molekulares Profil der Krankheit liefern können und den Vorteil haben, dass sie minimalinvasiv sind. Serielle Flüssigbiopsien können als Werkzeug dienen, um die räumliche und zeitliche Heterogenität zu identifizieren, die das Ansprechen oder die Resistenz auf gezielte Wirkstoffe vorhersagt, und können Aufschluss über das Auftreten (oder Verschwinden) spezifischer Mutationen geben, auf die möglicherweise neuere Antikrebswirkstoffe abzielen. Um dieser molekularen Heterogenität Rechnung zu tragen, sollten die genomischen Profile von Patienten mit metastasiertem Darmkrebs zu verschiedenen Zeitpunkten im Verlauf der Therapie mittels Flüssigbiopsie untersucht werden.

Es gab kleine Studien, die Mechanismen der Resistenz gegen monoklonale Anti-EGFR-Antikörper bei mCRC unter Verwendung von Flüssigbiopsie untersuchten. Eine Studie mit 37 mCRC-Patienten, die mit Cetuximab behandelt wurden, ergab, dass 40 % von ihnen bei Progression RAS-Mutationen entwickelten 10). Eine weitere Studie mit begrenzter Teilnehmerzahl untersuchte Patienten mit mCRC, die mit Panitumumab behandelt wurden, und stellte fest, dass 9 von 24 Patienten (38 %) während der Behandlung KRAS-Mutationen als Mechanismus der erworbenen Resistenz gegen die Anti-EGFR-Therapie entwickelten. Darüber hinaus verwendeten weniger Studien mit einer begrenzten Anzahl von Patienten die Flüssigbiopsie als Biomarker bei der erneuten Provokation von mCRC-Patienten mit monoklonalen EGFR-Antikörpern. Die Mehrzahl dieser Studien war retrospektiv. Eine war jedoch die erste prospektive Studie und hatte ein ähnliches Protokoll wie unsere Studie. Sie umfasste 28 Patienten und berichtete, dass 52 % dieser Patienten bei der erneuten Belastung mit Cetuximab vom RAS-Wildtyp waren – als diese Patienten Cetuximab in der Erstlinientherapie ausgesetzt waren und eine Progression unter Cetuximab hatten. Diese Studie zeigte, dass eine erneute Provokation mit Cetuximab das progressionsfreie Überleben signifikant verbesserte, wenn RAS als Wildtyp auf zirkulierender Tumor-DNA festgestellt wurde(12). Eine der Einschränkungen dieser Studie bestand darin, dass eine einzige Flüssigbiopsieprobe entnommen wurde (vor der erneuten Provokation mit Cetuximab) und daher nicht den vorhergesagten „Wechsel“ des RAS-Ziels zeigt, den die Forscher in unserer Studie untersuchen wollen. Darüber hinaus wurde bei BMC Cancer ein neueres Studienprotokoll veröffentlicht, in dem die Forscher planen, 120 Patienten zu untersuchen und alle 3 Monate eine Flüssigbiopsieanalyse durchzuführen, während die Patienten Cetuximab in erster Linie erhalten. Dies dient dazu, die Entwicklung des RAS-Ziels zu untersuchen und dies mit dem Ansprechen der Krankheit zu korrelieren sowie die Therapie mit EGFR-Inhibitoren bei mCRC-Patienten zu steuern. Auf der Grundlage begrenzter Daten haben die aktuellen Richtlinien jedoch noch keine Tests mit Flüssigbiopsie und der Verwendung dieser Strategie zur Entscheidung über eine erneute Herausforderung der Anti-EGFR-Therapie in der Drittlinieneinstellung übernommen oder nicht, was die Frage ist, die die Forscher in dieser Studie beantworten möchten.

Zirkulierende zellfreie DNA (cfDNA) besteht aus kleinen Nukleinsäurefragmenten, die durch Ruptur, Nekrose oder Apoptose aus normalen und verstorbenen Zellen freigesetzt werden, und wird nun zunehmend zum Nachweis von RAS- (und anderen) Mutationen bei Patienten mit fortgeschrittenem Darmkrebs verwendet. Es gibt neue Beweise dafür, dass die G12C-RAS-Mutation mit einem neuartigen Antikrebsmittel angegriffen werden kann.

Die Forscher zielen darauf ab, cfDNA-Tests an Patienten mit fortgeschrittenem Dickdarmkrebs durchzuführen, die keine RAS-Mutationen, d. h. Wildtyp, aufweisen (und daher mit EGFR-Inhibitoren beginnen – was eine Standardbehandlung ist) vor der Drittlinientherapie. Dies hilft dem behandelnden Arzt bei der Entscheidung, ob er diesen Patienten mit RAS-wt-Status einen monoklonalen Anti-EGFR-Antikörper oder eine Standard-Drittlinientherapie (Regorafenib oder TAS-102) geben soll. Diese Patienten werden über einen Zeitraum von 18 Monaten gesammelt. Der cfDNA-Test bei der zweiten Progression (d. h. vor der systemischen Drittlinientherapie) bestimmt, ob die Untergruppe von Patienten, die möglicherweise RAS-Mutation(en) nach Progression zur Erstlinientherapie (oder andere Mutationen als Resistenzmechanismus) mit Anti- Die monoklonalen EGFR-Antikörper haben ihren RAS-Status geändert und wurden zum Wildtyp. Dies wird die erneute Herausforderung von EGFR-Inhibitoren in der Drittlinieneinstellung unterstützen und hat das Potenzial, die Behandlungsrichtlinien für Darmkrebs zu ändern. Daraufhin entscheidet der leitende Prüfarzt, ob eine erneute Provokation mit einem Anti-EGFR-Inhibitor durchgeführt wird. Die Forscher wollen insgesamt 60 Patienten untersuchen und mindestens 30 Patienten in der Rechallenge-Gruppe (mit Anti-EGFR-mAb) haben.

Materialen und Methoden

Die Patienten erhalten ihre Standard-of-Care (SOC)-Biopsie der Tumor-/Metastasenstelle, um die Diagnose zu bestätigen und den RAS-Status zu bestimmen. Sobald der RAS-Wildtyp vorliegt und die Primärerkrankung linksseitig ist, erhalten diese Patienten eine Standard-Chemotherapie (wahlweise FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI) mit einem Anti-EGFR-mAb (Cetuximab oder Panitumumab). Bei Fortschreiten der Erkrankung wird eine systemische Zweitlinien-Chemotherapie +/- Anti-VEGF-Antikörper gemäß SOC verabreicht. Bei der zweiten Progression werden die Patienten gemäß den Einschlusskriterien und der Einwilligung in die Studie aufgenommen, ein cfDNA-Bluttest wird durchgeführt und der RAS-Status wird untersucht. Wenn RAS vom Wildtyp ist, entscheidet der Prüfarzt, ob er erneut mit einem Anti-EGFR-Antikörper (siehe Studienschema – Abbildung 1) herausgefordert wird oder SOC eine Drittlinien-Chemotherapie (Regorafenib oder TAS-102) verabreicht.

Die Beurteilung der Krankheit erfolgt alle 8 bis 12 Wochen gemäß SOC unter Verwendung von CT-Scans und/oder MRT und wird gemäß den RECIST-Kriterien v1.1 gemeldet.

Methoden für die cfDNA-Sequenzierung der nächsten Generation (NGS) von CRC-Patienten cfDNA-Extraktion Blutproben werden in K2EDTA-Röhrchen (BD Vacutainer® Blood Collection Tubes, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA) gesammelt und an das Translational Pathology Laboratory gesendet. Die Plasmafraktion wird von den Blutzellen durch zwei aufeinanderfolgende Zentrifugationsrunden für 30 Minuten bei Raumtemperatur bei 1600 × g getrennt. Das gesammelte Plasma wurde aliquotiert und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. cfDNA wird aus Plasmavolumina im Bereich von 0,4 bis 5,5 ml unter Verwendung des MagMax Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers extrahiert. Die cfDNA-Menge wurde mit dem dsDNA-HS-Assay-Kit mit dem Qubit 2.0 Fluorometer (Thermo Fisher Scientific) bestimmt. Die cfDNA-Qualität wurde mit dem Agilent Tap Station System (Agilent Technologies, Santa Clara, USA) bewertet. Nur cfDNA-Proben mit einem klaren Fragmentgrößenpeak zwischen 140-200 bp werden für die Analyse berücksichtigt.

NGS-Bibliotheksvorbereitung NGS-Bibliotheken werden aus 10 ng cfDNA nach dem Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay (Thermo Fisher Scientific) hergestellt. Unser allgemeines Bibliotheksvorbereitungsprotokoll basiert auf einer zweizyklischen Multiplex-Touchdown-PCR-Reaktion mit einem Temperaturbereich von 64 °C bis 58 °C, die es ermöglichte, Zielregionen zu amplifizieren und eindeutige molekulare Identifikatoren einzuführen. Die resultierenden markierten Amplikons mit einer Länge von etwa 100–140 bp werden dann unter Verwendung von Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, Brea, USA) bei einem Bead-zu-Probe-Verhältnis von 1,5 × gereinigt und gereinigte Produkte werden in 24 μl Puffer mit niedrigem TE eluiert. Eine zweite PCR-Runde (18 Zyklen) wird in einem Gesamtvolumen von 50 μl durchgeführt, um die gereinigten Amplikons zu amplifizieren und Ion Torrent™ Tag-Sequenzierungsadapter mit probenspezifischen Barcodes einzuführen. Die resultierende Bibliothek von Ziel-DNA-Fragmenten wird gereinigt, indem eine zweistufige Aufreinigung unter Verwendung von Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter) bei einem Bead-zu-Probe-Verhältnis von 1,15 × bzw. 1,0 × durchgeführt wird. Die gereinigten Bibliotheken werden dann 1:1000 verdünnt und durch qPCR unter Verwendung des Ion Universal Quantitation Kit (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert. Die quantifizierten Vorratsbibliotheken werden dann für die nachgelagerte Matrizenherstellung auf 100 pM verdünnt.

Sequenzierung NGS-Bibliotheken werden auf einem Ion S5™-Instrument (Thermo Fisher Scientific) unter Verwendung von Halbleiter-Sequenzierungstechnologie sequenziert. Kurz gesagt, Sequenzierungsläufe werden auf der Torrent Suite Software™ v5.10 geplant, Bibliotheken werden gepoolt und unter Verwendung des Ion Chef™-Instruments (Thermo Fisher Scientific) auf einen Ion 540™-Chip geladen. Der geladene Chip wird dann unter Verwendung von 500 Flüssen sequenziert. Rohdaten werden automatisch auf dem Torrent Server™ verarbeitet und mit dem Referenz-hg19-Genom abgeglichen. Die Qualitätskontrolle wird für jede Probe basierend auf den folgenden Metriken manuell durchgeführt; Anzahl der Reads pro Probe >15.000.000 (für Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay-Bibliotheken), On-Target-Reads >90 %, Read-Einheitlichkeit >90 %, mittlere molekulare Abdeckung >500×, mittlere Read-Abdeckung >15.000. Gewebe-NGS-Bibliotheken werden dann gemäß den Anweisungen des Herstellers sequenziert. Die Sequenzierungsdaten der QC-bestandenen Proben werden dann im BAM-Format auf den Ion Reporter™-Analyseserver zum Varianten-Calling und zur Kommentierung hochgeladen.

Datenanalyse Für Plasmaproben wird das Varianten-Calling auf der Ion Reporter™ (IR) Analysis Software v5.10 unter Verwendung der Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer Liquid Biopsy w2.0-Workflows durchgeführt. Die Analyse-Pipeline umfasst auch Signalverarbeitung, Base-Calling, Quality-Score-Zuweisung, Adapter-Trimmung, Entfernung von PCR-Duplikaten und Kontrolle der Mapping-Qualität. Abdeckungsmetriken für jedes Amplikon werden durch Ausführen der Coverage Analysis Plugin Software v5.6 (Thermo Fisher Scientific) erhalten. Identifizierte Varianten werden nur berücksichtigt, wenn die Variante eine molekulare Abdeckung von mindestens drei hatte, was darauf hinweist, dass die Variante in drei unabhängigen Templatmolekülen nachgewiesen wird. Schließlich werden alle Kandidatenmutationen manuell mit dem Integrative Genomics Viewer überprüft. Weitere Annotationen werden von der Qiagen QCI-Plattform und dem hauseigenen oLIMS-System durchgeführt.