진행성 결장직장암 환자의 RAS 돌연변이 검출에 순환 세포 유리 DNA(cfDNA) 사용을 활용한 전향적 연구.

결장직장암은 사우디아라비아에서 여전히 남성에게 가장 흔한 암이며 여성에게는 세 번째로 흔한 암입니다. 전이성 질환의 발현은 환자의 거의 1/3에서 발생하며 5년 생존율은 1기의 90%에서 일단 질환이 전이되면 14%로 크게 감소합니다. 돌연변이 암 특성화를 위해 쉽게 접근할 수 있는 유전적 바이오마커를 제공하기 위한 액체 생검의 가능성에 열광하고 있습니다. 표피 성장 인자 수용체(EGFR) 단클론 항체는 RAS 돌연변이(RAS 야생형)를 보유하지 않는 진행성 결장직장암의 치료에 널리 사용됩니다. 따라서 이러한 돌연변이의 존재가 cetuximab 및 panitumumab과 같은 EGFR 표적 항체에 대한 내성을 예측하기 때문에 발암성 RAS 돌연변이의 유전자형 분석은 그러한 환자에 대한 전신 요법을 시작하기 전에 수행하는 것이 필수적입니다. 전이성 CRC의 치료는 더욱 복잡해졌으며 최근 몇 년 동안 새로운 발암성(잠재적으로 표적화 가능한) 경로의 발견과 함께 정밀 의학 접근법이 발전했습니다. 전이성 결장직장암의 예후는 최상의 지지 요법으로 6개월에서 항 EGFR 항체를 포함한 다제 화학 요법 및 표적 요법으로 2년 이상으로 개선되었습니다. 혈관 내피 성장 인자 억제제를 추가하는 것과 같은 CRC의 다른 단일화 경로를 표적으로 삼는 것도 환자에게 도움이 되었습니다. 전이성 결장직장암(mCRC) 환자의 55%가 KRAS 및 NRAS에서 발암성 돌연변이를 가질 것으로 추정됩니다. 이러한 돌연변이의 검출은 침습적 절차라는 단점이 있는 조직 생검에서 수행되었으며, 조직의 단일 단편이 다음을 반영하기에 부적절할 수 있기 때문에 그러한 테스트가 질병의 진정한 돌연변이 부담을 반영하지 않을 수 있음을 시사하는 데이터 종양내 이질성. 액체 생검 또는 혈액 기반 돌연변이 프로파일링이 질병의 보다 포괄적인 분자 프로파일을 제공할 수 있고 최소 침습성이라는 이점을 제공할 수 있음을 시사하는 증거가 증가하고 있습니다. 일련의 액체 생검은 표적 약제에 대한 반응 또는 저항성을 예측하는 공간적 및 시간적 이질성을 식별하는 도구 역할을 할 수 있으며 잠재적으로 새로운 항암제로 표적이 될 수 있는 특정 돌연변이의 출현(또는 소멸)을 밝힐 수 있습니다. 이러한 분자적 이질성을 설명하기 위해 전이성 결장직장암 환자의 게놈 프로파일은 액체 생검을 사용하여 치료 과정 동안 다른 시점에서 검사되어야 합니다.

액체 생검을 사용하여 mCRC에서 항 EGFR 단클론 항체에 대한 내성 기전을 조사한 소규모 연구가 있었습니다. cetuximab으로 치료받은 37명의 mCRC 환자를 대상으로 한 연구에서 이들 중 40%에서 진행 시 RAS 돌연변이가 발생한 것으로 나타났습니다 10). 참가자 수가 제한된 또 다른 연구에서는 panitumumab으로 치료받은 mCRC 환자를 조사한 결과 24명의 환자 중 9명(38%)이 항 EGFR 요법에 대한 후천적 내성의 메커니즘으로 치료 중 KRAS 돌연변이를 개발한 것으로 나타났습니다. 또한 EGFR 단클론 항체로 mCRC 환자를 다시 도전할 때 액체 생검을 바이오마커로 사용한 제한된 수의 환자를 대상으로 한 연구는 거의 없었습니다. 이들 연구의 대부분은 후향적이었다. 그러나 하나는 첫 번째 전향적 시험이었고 우리 연구와 유사한 프로토콜을 가졌습니다. 여기에는 28명의 환자가 포함되었으며 이들 환자의 52%가 세툭시맙으로 재투여했을 때 RAS 야생형이었다고 보고했습니다. 이 연구는 RAS가 순환하는 종양 DNA에서 야생형인 것으로 밝혀졌을 때 cetuximab을 사용한 재도전이 무진행 생존을 상당히 향상시켰음을 보여주었습니다(12). 이 연구의 한계 중 하나는 단일 액체 생검 샘플이 수행되었고(세툭시맙으로 다시 도전하기 전에) 조사자가 우리 시험에서 연구할 계획인 RAS 표적의 예측된 "스위치"를 표시하지 않는다는 것입니다. 또한, 보다 최근 연구 프로토콜이 BMC Cancer에서 발표되었으며, 연구자들은 환자가 1차 세툭시맙을 투여받는 동안 120명의 환자를 연구하고 3개월마다 액체 생검 분석을 수행할 계획입니다. 이것은 RAS 표적의 진화를 연구하고 이를 질병 반응과 연관시키고 mCRC 환자에서 EGFR 억제제를 사용한 치료 지침을 돕기 위한 것입니다. 그러나 제한된 데이터를 기반으로 현재 가이드라인은 아직 액체 생검을 사용하는 테스트를 채택하지 않았으며 이 전략을 사용하여 3차 설정에서 항 EGFR 요법의 재도전 여부를 결정하는데, 이는 연구자가 이 연구에서 답하고자 하는 질문입니다.

cfDNA(Circulating cell free DNA)는 정상 및 사멸 세포에서 발생하는 파열, 괴사 또는 세포자살에 의해 세포에서 유리된 작은 핵산 조각으로 구성되며 현재 진행성 결장직장암 환자의 RAS(및 기타) 돌연변이를 검출하는 데 점점 더 많이 사용되고 있습니다. G12C RAS ​​돌연변이가 새로운 항암제로 표적이 될 수 있다는 새로운 증거가 있습니다.

조사관은 RAS 돌연변이가 없는 진행성 결장직장암 환자, 즉 야생형(따라서 치료 표준인 EGFR 억제제에서 시작) 3차 요법 전에 cfDNA 테스트를 수행하는 것을 목표로 합니다. 이는 치료 의사가 RAS wt 상태 환자에게 항-EGFR 단클론 항체 또는 표준 3차 요법(레고라페닙 또는 TAS-102)을 제공할지 여부를 결정하는 데 도움이 될 것입니다. 이 환자들은 18개월 동안 수집됩니다. 2차 진행 시(즉, 3차 전신 요법 이전) cfDNA 테스트는 1차 요법(또는 내성 기전으로서의 다른 돌연변이)으로 진행한 후 RAS 돌연변이가 발생했을 수 있는 환자의 하위 집합이 항- EGFR 단클론 항체는 RAS 상태를 전환하여 야생형이 되었습니다. 이는 3차 치료 환경에서 EGFR 억제제의 재도전을 뒷받침하고 대장암 치료 가이드라인을 바꿀 가능성이 있다. 이에 따라 주임연구원은 항 EGFR 억제제로 재도전할지 여부를 결정할 예정이다. 연구자들은 총 60명의 환자를 연구하고 적어도 30명의 환자를 재시험(항 EGFR mAb 사용) 그룹에 포함시키는 것을 목표로 합니다.

재료 및 방법

환자는 진단을 확인하고 RAS 상태를 결정하기 위해 종양/전이 부위의 표준 치료(SOC) 생검을 받게 됩니다. 일단 RAS 야생형이 되고 원발성 질병이 왼쪽이면, 이 환자들은 항 EGFR mAb(세툭시맙 또는 파니투무맙)와 함께 표준 화학요법(FOLFOX, FLOFIRI, CapeOX, XELIRI 중 선택)을 받게 됩니다. 질병 진행 시 SOC에 따라 2차 전신 화학요법 +/- 항 VEGF 항체가 제공됩니다. 두 번째 진행 시 환자는 포함 기준 및 동의에 따라 연구에 등록되고 cfDNA 혈액 검사가 실시되며 RAS 상태가 검사됩니다. RAS가 야생형인 경우 조사자는 항 EGFR 항체(연구 스키마 - 그림 1 참조)로 다시 도전할지 아니면 SOC 3차 화학요법(레고라페닙 또는 TAS-102)을 제공할지 결정할 것입니다.

질병 평가는 CT 스캔 및/또는 MRI를 사용하여 SOC에 따라 8 - 12주마다 수행되며 RECIST 기준 v1.1에 따라 보고됩니다.

CRC 환자의 cfDNA NGS(Next Generation Sequencing) 방법 cfDNA 추출 혈액 샘플을 K2EDTA 튜브(BD Vacutainer® 혈액 수집 튜브, Becton Dickinson, Franklin Lakes, USA)에 수집하여 Translational Pathology Laboratory로 보냅니다. 혈장 분획은 1600 × g의 실온에서 30분 동안 2회 연속 원심분리하여 혈액 세포에서 분리됩니다. 채취한 혈장은 분주하여 사용할 때까지 -80°C에서 보관하였다. cfDNA는 제조업체의 지침에 따라 MagMax Cell-Free Total Nucleic Acid Isolation Kit(Thermo Fisher Scientific, Waltham, USA)를 사용하여 0.4~5.5ml 범위의 혈장 부피에서 추출됩니다. cfDNA 양은 Qubit 2.0 Fluorometer(Thermo Fisher Scientific)의 dsDNA HS 분석 키트로 평가되었습니다. cfDNA 품질은 Agilent Tap Station System(Agilent Technologies, Santa Clara, USA)으로 평가했습니다. 140-200 bp 사이의 명확한 조각 크기 피크가 있는 cfDNA 샘플만 분석 대상으로 간주됩니다.

NGS 라이브러리 준비 NGS 라이브러리는 Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay(Thermo Fisher Scientific)에 따라 10ng의 cfDNA에서 준비됩니다. 당사의 일반 라이브러리 준비 프로토콜은 64°C ~ 58°C의 온도 범위에서 2주기 멀티플렉스 터치다운 PCR 반응을 기반으로 하여 대상 영역을 증폭하고 고유한 분자 식별자를 도입할 수 있습니다. 약 100-140 bp 길이의 생성된 태그 앰플리콘은 1.5X의 비드 대 샘플 비율에서 Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter, Brea, USA)를 사용하여 정리되고 정제된 제품은 24 μl 저 TE 완충액에서 용출됩니다. 2차 PCR(18주기)은 총 부피 50μl에서 수행되어 정제된 앰플리콘을 증폭하고 샘플별 바코드가 포함된 Ion Torrent™ 태그 시퀀싱 어댑터를 도입합니다. 생성된 표적 DNA 단편 라이브러리는 Agencourt AMPure XP(Beckman Coulter)를 사용하여 각각 1.15x 및 1.0x의 비드 대 시료 비율로 2단계 정리를 수행하여 정제됩니다. 그런 다음 정제된 라이브러리를 다시 1:1000으로 희석하고 Ion Universal Quantitation Kit(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 qPCR로 정량화합니다. 그런 다음 정량화된 스톡 라이브러리를 다운스트림 템플릿 준비를 위해 100pM으로 희석합니다.

시퀀싱 NGS 라이브러리는 반도체 시퀀싱 기술을 사용하여 Ion S5™ 기기(Thermo Fisher Scientific)에서 시퀀싱됩니다. 간단히 말해 시퀀싱 실행은 Torrent Suite Software™ v5.10에서 계획되고 라이브러리는 Ion Chef™ 기기(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 Ion 540™ 칩에 풀링 및 로드됩니다. 로드된 칩은 500개의 흐름을 사용하여 시퀀싱됩니다. 원시 데이터는 Torrent Server™에서 자동으로 처리되고 참조 hg19 게놈에 정렬됩니다. QC는 다음 메트릭을 기반으로 각 샘플에 대해 수동으로 수행됩니다. 샘플당 판독 수 >15,000,000(Oncomine™ Pan-Cancer Cell-Free Assay 라이브러리의 경우), 표적 판독 >90%, 판독 균일성 >90%, 중간 분자 범위 >500×, 중앙 판독 범위 >15,000. 그런 다음 조직 NGS 라이브러리는 제조업체의 지침에 따라 시퀀싱됩니다. QC 통과 샘플의 시퀀싱 데이터는 BAM 형식으로 Ion Reporter™ 분석 서버에 업로드되어 변형 호출 및 주석이 추가됩니다.

데이터 분석 혈장 샘플의 변이 호출은 Oncomine™ TagSeq Pan-Cancer 액체 생검 w2.0 워크플로우를 사용하여 Ion Reporter™(IR) 분석 소프트웨어 v5.10에서 수행됩니다. 분석 파이프라인에는 신호 처리, 기본 호출, 품질 점수 할당, 어댑터 트리밍, PCR 중복 제거 및 매핑 품질 제어도 포함됩니다. Coverage Analysis Plugin 소프트웨어 v5.6(Thermo Fisher Scientific)을 실행하여 각 앰플리콘에 대한 커버리지 메트릭을 얻습니다. 식별된 변이체는 변이체가 3개 이상의 분자 범위를 가지고 있는 경우에만 고려되며, 이는 변이체가 3개의 독립적인 주형 분자에서 감지되었음을 나타냅니다. 마지막으로 Integrative Genomics Viewer를 사용하여 모든 후보 돌연변이를 수동으로 검토합니다. 추가 주석은 Qiagen QCI 플랫폼 및 사내 oLIMS 시스템에서 수행됩니다.