食用益生菌罗伊氏乳杆菌 Prodentis 对正畸患者牙龈沟液炎症反应和口腔微生物组宏基因组特征的影响。

研究的基本原理和背景

美学是寻求正畸治疗的患者的首要考虑因素。 然而，除了美学方面，牙齿排列不齐还可能导致影响口腔功能的健康问题，例如咀嚼、言语和由于牙面美学受损而导致的社会心理问题。 因此，接受固定正畸治疗的受试者可能会遇到一些与口腔健康相关的问题。 已知固定正畸治疗会使受试者面临重度牙菌斑积聚的风险，这会改变口腔微生物组的共生生态系统。 这导致口腔微生物群失调，其中含有更多致病菌种。 已显示致病性变形链球菌、牙龈卟啉单胞菌、伴放线放线菌和白色念珠菌存在于对口腔卫生程序不够重视的正畸患者中。

变形链球菌是一种兼性厌氧革兰氏阳性口腔细菌，在龋齿的形成中起重要作用。 P. gingivalis 和 A. actinomycetemcomitans 是一种与牙周炎相关的厌氧革兰氏阴性口腔细菌。 来自国家健康和营养检查调查 (NHANES III) 的数据表明，美国 20 岁以上的正畸患者中有 14% 患有中度至重度牙周炎。 此外，已显示这些患者牙周袋中白色念珠菌的存在和致病潜力。 C. albicans 是一种强大的生物膜形成生物，呈现治疗并发症。

罗伊氏乳杆菌是一种共生的口腔益生菌，已知可产生抗菌化合物罗伊氏菌素。 这种广谱抗菌剂的结构与甘油发酵过程中形成的羟基丙醛有关。 先前的研究表明罗伊氏素对致病性口腔细菌具有有益作用。 此外，用作口香糖或酸奶是安全的。 此外，先前的研究发现，含有罗伊氏乳杆菌的口香糖可有效减少中度至重度牙龈炎患者的牙菌斑积聚和牙龈炎。 因此，含有罗伊氏乳杆菌的口香糖有相当多的证据可用于改善口腔健康。

初步数据：作为一项试点研究，研究人员收集了八名正畸患者（平均年龄 21 岁）在每天摄入益生菌之前和之后两周的唾液样本。 从每个受试者中收集一式两份的样本。 结果显示，食用益生菌后变形链球菌血清型 c、变形链球菌血清型 d、牙龈卟啉单胞菌和伴放线放线菌显着减少 (p<0.05)。

研究差距：L. reuteri 调节炎症反应的能力，即。 白细胞介素 1 β、白细胞介素 6、白细胞介素 8、白细胞介素 10、TNF α、MMP-9 和 RANKL 以及对接受正畸治疗的患者口腔宏基因组微生物组谱的影响之前尚未进行过研究。

材料和方法

用于比较的罗伊氏乳杆菌 Prodentis 含片和安慰剂均从瑞典斯德哥尔摩的 BioGaia 运来。 含片的双盲编号是在发货前为研究人员进行的，以防止偏差，因此，唯一了解含片治疗和安慰剂差异信息的是 BioGaia。 测试对象和研究人员都没有关于锭剂差异的知识。

BioGaia Prodentis 含片是一种口腔健康食品补充剂，含有专利乳酸菌 Limosilactobacillus reuteri（以前称为 Lactobacillus reuteri）Prodentis（L. reuteri DSM 17938 和 L. reuteriATCC PTA 5289 的菌株组合），可帮助有益微生物保持健康口中的自然平衡。 本产品日常使用安全，孕期和哺乳期均可使用。 该产品的成分：填充剂（益寿糖）、罗伊氏乳杆菌 DSM 17938 和罗伊氏乳杆菌 ATCC PTA 5289、全氢化棕榈油、薄荷香精、薄荷醇香精、薄荷油和甜味剂（三氯蔗糖）。 一个锭剂包含至少 2 亿活的罗伊氏乳杆菌。 每锭净重 800 毫克。 由于产品中含有甜味剂，过量食用可能有通便作用。

研究课题：

为了评估其临床疗效，含益生菌罗伊氏乳杆菌的锭剂将用于接受先前试验研究中所述的固定正畸治疗的患者。 将进行一项使用平行设计的随机对照试验，试验组有 21 名受试者，对照组有 21 名受试者。 样本量计算是通过假设对照组口腔病原体没有变化而测试组在初步研究中观察到的减少来进行的。 考虑到具有 0.05 显着性水平和 80% 功效的双侧检验检测两组之间的这种差异，每组需要 21 名受试者。

受试者为正在接受固定矫治器正畸治疗的Trisakti大学牙科学院的学生志愿者或患者，纳入标准如下：年龄18-28岁，男女不限；最近一年接受过固定矫治器正畸治疗；不消耗益生菌（最少 3 个月前）；未服用抗生素等药物（至少 3 个月前）且 PBI 评分 >1。 排除标准为全身性疾病和对益生菌过敏者。 受试者由作为研究团队成员的一名在读研究生招募。 不愿意或不愿意的受试者候选人可以直接全心拒绝招募邀请，因此全心招募的志愿者同意成为本研究的测试对象。 然后，招募的受试者将被随机分配到测试中。

进行 3 个样品采集的时间约为 15 分钟。 采样将在 Trisakti 大学牙科医院牙科学院的行政诊所进行。 参与者将在研究期间获得牙膏和牙刷，受试者需要每天刷牙两次。 益生菌的消耗将在正畸控制后 2 周进行。 将收集两次样本：第一天（食用含片前）和受试者食用含益生菌罗伊氏乳杆菌的含片后第 14 天。 益生菌在早餐和刷牙后每天服用一次，持续两周。

样本采集方法 在样本采集之前，首先确认由于当前的Covid-19大流行（2020年9月30日），每个受试者都进行了SARS-CoV2检测的快速抗原测试，其中测试结果必须是每个患者的阴性结果。 阴性结果表明该受试者过去没有感染过 SARS-CoV2。 确认后，在正畸控制后至少两周内，由配备全套个人防护设备的牙医/医学专家收集受试者的样本。

使用引流法收集唾液样本。 让受试者安静地坐着，同时低下头并张开嘴巴让唾液从下唇被动滴落。 使用无菌、预称重的试管收集唾液。 受试者应处于禁食状态/早餐后两小时。 在收集唾液样本之前，受试者不应刷牙至少 45 分钟。 唾液采集后，如果不立即进行分析，建议将唾液样本储存在 -20oC。 此外，最好在多个试管中分装和冷冻样品，以避免可能降低唾液质量的冻融循环。

通过使用无菌牙签擦拭个体第一恒磨牙的所有（颊侧/近中/远侧/舌侧/咬合）表面来收集牙菌斑样品。 然后将斑块样品转移到无菌磷酸盐缓冲盐水 (PBS) 中。 收集后，将斑块样品储存在 -20oC 下，直到进行进一步分析。

使用吸水纸条技术收集龈沟液 (GCF) 样本。 将吸水纸条轻轻地放在几个选定的位置。 在感觉到耐光性后移除条带，大约放置 30 秒后。 将一个受试者的多个纸条汇集到几个 1.5 ml 微量离心管中，该离心管在 4oC 下含有 100 µl PBS。 随后将试管储存在 -20oC 并用于进一步分析。

第一部分：使用ELISA方法评估益生菌对正畸患者牙龈炎症反应疗效的临床试验。

为了评估其临床疗效，含有罗伊氏乳杆菌的益生菌含片将用于接受先前试验研究中所述的固定正畸治疗的患者。 测试组中的受试者将在早餐和刷牙后接受为期两周的每日服用益生菌锭剂（2x108 CFU/片剂）。 将在第一天和第十四天从所有受试者中收集样本。 牙龈沟液、唾液和牙菌斑样本将在组分配之前使用先前描述的标准方法从招募的受试者中收集 [30]。 采集的样品将保存在冷藏箱中，并放置在-80°C 的实验室冰箱中。 这些样本将用于使用 ELISA 方法（BioLegend，美国圣地亚哥）分析白细胞介素 1-β、白细胞介素 6、白细胞介素 8、白细胞介素 10、TNF α、MMP-9 和 RANKL 水平。

第二部分：使用 NGS 评估益生菌对正畸患者宏基因组口腔微生物组影响的临床试验将从每组收集唾液和牙菌斑样本。 研究人员将对每次测序运行的 40 个样本进行微生物组分析。 使用 MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit 或 Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit 提取收集样品的细菌和真菌 DNA。 提取方法将遵循试剂盒的制造协议。 提取的 DNA 将使用 Nanodrop 进行质量检查。 gDNA 的浓度将使用 Qubit 荧光计测量。 每个样品的推荐 gDNA 浓度为 5 ng/uL。 在质量控制之后，将使用 PCR 扩增每个样本的 16S 和 18S rRNA 基因的 V3-V4 区域。 在文库制备过程中，根据制造商的说明，使用 Nextera XT Index Kit（Illumina，美国）将产生的扩增子转化为文库。 所有生成的文库将使用 Qubit 荧光计进行评估，并将使用 iSeq 100 平台（Illumina，美国）进行测序。 测序参数将为 300 个循环，PhiX 对照加入 5%。 可以使用 Illumina Local Run Manager 软件查看来自序列运行的可视化微生物分析数据。