Probioottisen Lactobacillus Reuteri Prodentiksen kulutuksen vaikutus ienreuman nesteen tulehdusvasteeseen ja suun mikrobiomin metagenomissiin profiileihin oikomispotilailla.

Tutkimuksen perustelut ja tausta

Estetiikka on ensisijainen näkökohta oikomishoitoa hakeville potilaille. Esteettisten näkökohtien lisäksi hampaiden asento voi aiheuttaa myös suun toimintaan vaikuttavia terveysongelmia, kuten pureskelu-, puhe- ja psykososiaalisia ongelmia, jotka johtuvat hampaiden estetiikasta. Näin ollen kiinteässä oikomishoidossa olevat voivat kohdata useita suun terveyteen liittyviä ongelmia. Kiinteän oikomishoidon tiedetään asettavan potilaan raskaan hammasplakin kerääntymisen riskiin, mikä muuttaa suun mikrobiomin symbioottista ekosysteemiä. Tämä johtaa dysbioottiseen suun mikrobiomiin, jossa on enemmän patogeenisiä lajeja. Patogeenisten S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans ja C. albicans on osoitettu esiintyvän oikomispotilailla, jotka eivät kiinnitä tarpeeksi huomiota suuhygieniaan.

S. mutans on fakultatiivinen anaerobinen grampositiivinen suun bakteeri, jolla on tärkeä rooli hammaskarieksen kehittymisessä. P. gingivalis ja A. actinomycetemcomitans ovat anaerobisia gramnegatiivisia suun bakteereita, jotka liittyvät parodontiittiin. National Health and Nutrition Examination Surveyn (NHANES III) tiedot viittaavat siihen, että 14 prosentilla Yhdysvalloissa yli 20-vuotiaista oikomispotilaista on kohtalainen tai vaikea parodontiitti. Lisäksi on osoitettu C. albicansin esiintyminen ja patogeeninen potentiaali näiden potilaiden parodontaalitaskussa. C. albicans on vankka biofilmiä muodostava organismi, joka aiheuttaa terapeuttisia komplikaatioita.

L. reuteri on kommensaalinen oraalinen probioottibakteeri, jonka tiedetään tuottavan antibakteerista yhdistettä, reuteriinia. Tämän laajakirjoisen antimikrobisen aineen rakenne on sukua hydroksipropionaldehydille, joka muodostui glyserolin kanssa käymisen aikana. Aiemmat tutkimukset ovat osoittaneet reuteriinin suotuisan vaikutuksen patogeenisiä suun bakteereja vastaan. Lisäksi sitä on turvallista käyttää purukumina tai jogurttina. Lisäksi aikaisemmassa tutkimuksessa havaittiin, että L. reuteria sisältävä purukumi vähensi tehokkaasti plakin kertymistä ja ientulehdusta potilaalla, jolla on kohtalainen tai vaikea ientulehdus. Siksi L. reuteria sisältävällä purukumilla on huomattavaa näyttöä käytettäväksi suun terveyden parantamiseksi.

Alustavat tiedot: Pilottitutkimuksena tutkijat keräsivät sylkinäytteet kahdeksalta oikomispotilaalta (keski-ikä 21 vuotta) ennen päivittäistä probioottien käyttöä ja kaksi viikkoa sen jälkeen. Jokaisesta koehenkilöstä otettiin kaksoisnäyte. Tulokset osoittivat S. mutans serotyypin c, S. mutans serotyypin d, P. gingivalis ja A. actinomycetemcomitansin merkittäviä vähenemistä probioottien käytön jälkeen (p < 0,05).

Tutkimusvaje: L. reuterin kyky moduloida tulehdusvastetta eli tulehdusreaktiota. Interleukiini 1 beeta, interleukiini 6, interleukiini 8, interleukiini 10, TNF alfa, MMP-9 ja RANKL sekä vaikutusta suun metagenomiseen mikrobiomiprofiiliin ortodonttihoitoa saavilla potilailla ei ole aiemmin tutkittu.

Materiaalit ja menetelmät

Lactobacillus reuteri Prodentis -imeskelytabletit, vertailukelpoiset lumelääkkeet, lähetettiin BioGaiasta Tukholmasta Ruotsista. Imeilevien imeskelytablettien kaksoissokkonumerointi tehtiin ennen lähettämistä tutkijoiden harhautumisen estämiseksi, joten ainoa osapuoli, jolla on tietoa imeskelytablettien eroista hoidon ja lumelääkkeen välillä, on BioGaia. Koehenkilöillä tai tutkijoilla ei ole tietoa imeskelytablettien eroista.

BioGaia Prodentis imeskelytabletit on suun terveyteen tarkoitettu ravintolisä, joka sisältää patentoitua maitohappobakteeria Limosilactobacillus reuteri (aiemmin Lactobacillus reuteri) Prodentis (L. reuteri DSM 17938:n ja L. reuteriin ATCC PTA 5289:n yhdistelmä), joka auttaa säilyttämään hyvän mikro-organismin. luonnollinen tasapaino suussa. Tämä tuote on turvallinen päivittäiseen käyttöön ja sitä voidaan käyttää raskauden ja imetyksen aikana. Tämän tuotteen ainesosat: täyteaine (isomalti), L. reuteri DSM 17938 ja L. reuteri ATCC PTA 5289, täysin hydrattu palmuöljy, piparminttuaromi, mentoliaromi, piparminttuöljy ja makeutusaine (sukraloosi). Yksi imeskelytabletti sisältää vähintään 200 miljoonaa elävää L. reuteriProdentista. Nettopaino per imeskelytabletti, 800 mg. Liiallisella käytöllä voi olla laksatiivisia vaikutuksia tuotteen sisältämien makeutusaineiden vuoksi.

Tutkimusaihe:

Kliinisen tehokkuuden arvioimiseksi probioottisia L. reuteria sisältäviä imeskelytabletteja käytetään potilaille, jotka saavat kiinteää oikomishoitoa aiemmin pilottitutkimuksessa kuvatulla tavalla. Suoritetaan satunnaistettu kontrolloitu tutkimus, jossa käytetään rinnakkaista suunnittelua ja jossa on 21 koehenkilöä testiryhmässä ja 21 koehenkilöä kontrolliryhmässä. Otoskoon laskeminen suoritettiin olettaen, että kontrolliryhmällä ei ole muutosta oraalisissa taudinaiheuttajissa, kun taas testiryhmässä pilottitutkimuksessa havaitaan vähenemistä. Kun otetaan huomioon kaksipuolinen testi, jonka merkitsevyystaso on 0,05 ja teho 80 % tällaisten erojen havaitsemisessa kahden ryhmän välillä, vaadittaisiin 21 koehenkilöä kussakin ryhmässä.

Tutkittavat ovat Trisakti-yliopiston Hammaslääketieteellisen tiedekunnan vapaaehtoisia opiskelijoita tai potilaita, jotka saavat oikomishoitoa kiinteällä laitteella seuraavin mukaanottokriteerein: 18-28-vuotiaat kummasta tahansa sukupuolesta; olet ollut oikomishoidossa kiinteällä laitteella viimeisen vuoden ajan; ei probioottien käyttöä (min. 3 kuukautta ennen); ei lääkkeitä, kuten antibioottia (vähintään 3 kuukautta ennen) ja PBI-pisteet >1. Poissulkemiskriteerit koskevat systeemisiä sairauksia ja allergisia probiooteille. Koehenkilöt rekrytoi käynnissä oleva jatko-opiskelija, joka oli osa tutkimusryhmää. Vastahakoiset tai haluttomat koehenkilöehdokkaat voivat suoraan kieltäytyä rekrytointikutsusta koko sydämestään, joten rekrytoidut vapaaehtoiset suostuivat tulemaan tämän tutkimuksen koehenkilöiksi. Rekrytoidut koehenkilöt määrätään sitten satunnaisesti kokeeseen.

Kolmen näytteen keräämiseen kului noin 15 minuuttia. Näytteenotto suoritetaan Hammaslääketieteellisen tiedekunnan johtoasemalla, Trisaktin yliopistollinen hammaslääkärisairaala. Osallistujille jaetaan hammastahnaa ja hammasharjaa opintojakson aikana ja hampaat on pestävä kaksi kertaa päivässä. Probiootteja nautitaan 2 viikon kuluttua oikomishoidosta. Näytteet otetaan kahdesti: ensimmäisenä päivänä (ennen imeskelytablettien nauttimista) ja 14. päivänä sen jälkeen, kun koehenkilö oli nauttinut probioottia L. reuteria sisältäviä pastillit. Probiootteja otetaan kerran päivässä kahden viikon ajan aamiaisen ja hampaiden harjauksen jälkeen.

Näytteenottomenetelmät Ennen näytteenottoa vahvistettiin ensin, että jokaiselle koehenkilölle on tehty SARS-CoV2:n nopea antigeenitesti nykyisen Covid-19-pandemian vuoksi (30.9.2020), jossa testin tuloksen tulee olla negatiivinen tulos jokaiselle potilaalle. Negatiivinen tulos osoittaa, että kohteella ei ole aiempaa SARS-CoV2-infektiota. Vahvistuksen jälkeen hammaslääkäri/lääkäri, joka oli varustettu täydellisillä henkilösuojaimilla, otti näytenäytteet koehenkilöiltä vähintään kahden viikon kuluessa oikomishoidon tarkastuksesta.

Sylkinäyte kerätään valutusmenetelmällä. Kohde saatetaan istumaan hiljaa samalla kun hän taivutetaan päätään ja avataan suu, jotta sylki valuu passiivisesti alahuulelta. Sylki kerätään steriileillä, esipainotetuilla putkilla. Koehenkilöiden tulee olla paastotilassa / kaksi tuntia aamiaisen jälkeen. Koehenkilöt eivät saa harjata hampaitaan vähintään 45 minuuttiin ennen sylkinäytteenottoa. Syljenkeräyksen jälkeen on suositeltavaa säilyttää sylkinäytteet -20oC:ssa, mikäli analyysiä ei tehdä heti. Lisäksi on parempi jakaa ja jäädyttää näytteet useisiin putkiin, jotta vältetään jäädytys-sulatusjaksot, jotka voivat heikentää syljen laatua.

Plakkinäyte kerätään pyyhkäisemällä yksittäisen pysyvän ensimmäisen poskihaavan kaikki (bukkaalinen/mesiaalinen/distaalinen/linguaalinen/okklusaalinen) pinnat steriilillä hammastikulla. Plakkinäyte siirrettiin sitten steriiliin fosfaattipuskuroituun suolaliuokseen (PBS). Keräyksen jälkeen plakkinäyte säilytetään -20 oC:ssa lisäanalyysiin asti.

Gingival crevicular fluid (GCF) -näyte kerätään käyttämällä imukykyistä paperinauhatekniikkaa. Imukykyinen paperinauha asetetaan varovasti usealle valitulle paikalle. Nauha poistetaan, kun kevyt vastus on tuntunut, noin 30 sekunnin kuluttua. Useita paperiliuskoja yhdelle koehenkilölle yhdistetään useisiin 1,5 ml:n mikrosentrifugiputkeen, jotka sisältävät 100 µl PBS:ää 4 °C:ssa. Putket säilytettiin tämän jälkeen -20 oC:ssa ja käytettiin jatkoanalyyseihin.

Osa I: Kliininen tutkimus probioottien tehon arvioimiseksi oikomispotilaiden ientulehdusvasteessa ELISA-menetelmällä.

Kliinisen tehokkuuden arvioimiseksi probioottisia, L. reuteria sisältäviä imeskelytabletteja käytetään potilaille, jotka saavat kiinteää oikomishoitoa aiemmin pilottitutkimuksessa kuvatulla tavalla. Testiryhmän koehenkilöille annetaan kaksi viikkoa päivittäin probioottisia imeskelytabletteja (2 x 108 CFU/tabletti) aamiaisen ja hampaiden harjauksen jälkeen. Näytteet kerätään kaikilta koehenkilöiltä ensimmäisenä ja neljäntoista päivänä. Ienneste-, sylki- ja hammasplakkinäytteet kerätään rekrytoiduilta koehenkilöiltä ennen ryhmäjakoa käyttämällä standardimenetelmiä, kuten aiemmin on kuvattu [30]. Kerätyt näytteet säilytetään kylmälaatikossa ja sijoitetaan laboratoriojääkaappiin -80°C:een. Näytteitä käytetään interleukiini 1-beeta-, interleukiini 6-, interleukiini 8-, interleukiini 10-, TNF-alfa-, MMP-9- ja RANKL-tason analysointiin ELISA-menetelmällä (BioLegend, San Diego, USA).

Osa II: Kliininen tutkimus probioottisen vaikutuksen arvioimiseksi metagenomiseen suun mikrobiomiin oikomispotilailla käyttämällä NGS-sylkeä ja plakkinäyte kerätään kustakin ryhmästä. Tutkijat tekevät mikrobiomiprofiloinnin 40 näytteelle jokaisella sekvensointiajolla. Kerättyjen näytteiden bakteeri- ja sieni-DNA uutetaan käyttämällä MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit- tai Qiagen QIAamp® DNA Mini Kitiä. Uuttomenetelmä noudattaa sarjan valmistusprotokollaa. Uutettu DNA testataan Nanodropin avulla. gDNA:n pitoisuus mitataan käyttämällä Qubit-fluorometriä. Suositeltu gDNA-pitoisuus kustakin näytteestä on 5 ng/uL. Laadunvalvonnan jälkeen kunkin näytteen 16S- ja 18S-rRNA-geenin V3-V4-alueet monistetaan käyttämällä PCR:ää. Kirjaston valmistuksen aikana saadut amplikonit muunnetaan kirjastoksi käyttämällä Nextera XT Index Kit -pakkausta (Illumina, US) valmistajan ohjeiden mukaisesti. Kaikki tuloksena olevat kirjastot arvioidaan käyttämällä Qubit-fluorometriä ja sekvensoidaan käyttämällä iSeq 100 -alustaa (Illumina, USA). Sekvensointiparametri on 300 sykliä ja PhiX-ohjauspiikki on 5 %. Sekvenssiajon visualisoituja mikrobiprofilointitietoja voidaan tarkastella Illumina Local Run Manager -ohjelmistolla.