O efeito do consumo de probiótico Lactobacillus Reuteri Prodentis na resposta inflamatória do fluido crevicular gengival e nos perfis metagenômicos do microbioma oral em pacientes ortodônticos.

Justificativa e antecedentes do estudo

A estética é uma consideração primordial para os pacientes que procuram tratamento ortodôntico. No entanto, além dos aspectos estéticos, o desalinhamento dos dentes também pode causar problemas de saúde que afetam a função oral, como mastigação, fala e problemas psicossociais devido à estética dentofacial prejudicada. Assim, os indivíduos submetidos a tratamento ortodôntico fixo podem se deparar com diversos problemas relacionados à saúde bucal. O tratamento ortodôntico fixo é conhecido por colocar o sujeito em risco de acúmulo de placa dental pesada que altera o ecossistema simbiótico do microbioma oral. Isso leva a um microbioma oral disbiótico que abriga mais espécies patogênicas. Tem sido demonstrado que S. mutans patogênicos, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans e C. albicans estão presentes em pacientes ortodônticos que não prestam atenção suficiente aos procedimentos de higiene bucal.

S. mutans é uma bactéria oral gram-positiva anaeróbica facultativa que tem um papel importante no desenvolvimento da cárie dentária. P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans são bactérias orais Gram-negativas anaeróbicas associadas à periodontite. Dados do National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III) sugerem que 14% dos pacientes ortodônticos nos EUA com mais de 20 anos de idade têm periodontite moderada a grave. Além disso, foi demonstrada a presença e o potencial patogênico de C. albicans na bolsa periodontal desses pacientes. C. albicans é um organismo robusto formador de biofilme, apresentando complicação terapêutica.

L. reuteri é uma bactéria probiótica oral comensal, conhecida por produzir um composto antibacteriano, a reuterina. A estrutura desse antimicrobiano de amplo espectro está relacionada ao hidroxipropionaldeído, formado durante a fermentação com glicerol. Estudos anteriores mostraram efeito benéfico da reuterina contra bactérias orais patogênicas. Além disso, é seguro para ser usado como gomas de mascar ou iogurtes. Além disso, um estudo anterior descobriu que a goma contendo L. reuteri foi eficaz na redução do acúmulo de placa e gengivite em pacientes com gengivite moderada a grave. Portanto, a goma de mascar contendo L. reuteri tem evidências consideráveis ​​para ser usada para melhorar a saúde bucal.

Dados preliminares: Como um estudo piloto, os investigadores coletaram amostras de saliva de oito pacientes ortodônticos (idade média de 21 anos) antes e duas semanas após o consumo diário de probióticos. Uma amostra duplicada foi coletada de cada sujeito. Os resultados mostraram reduções significativas em S. mutans sorotipo c, S. mutans sorotipo d, P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans após o consumo de probiótico (p<0,05).

Lacuna de pesquisa: A capacidade de L. reuteri em modular a resposta inflamatória viz. Interleucina 1 beta, Interleucina 6, interleucina 8, interleucina 10, TNF alfa, MMP-9 e RANKL e o efeito no perfil do microbioma metagenômico oral em pacientes submetidos a tratamento ortodôntico não foram previamente investigados.

Materiais e métodos

As pastilhas de Lactobacillus reuteri Prodentis, juntamente com os placebos para comparação, foram enviadas de BioGaia, Estocolmo, Suécia. A numeração duplo-cega para as pastilhas foi feita antes do envio para os pesquisadores para evitar viés, portanto, a única parte que tem informações sobre a diferença das pastilhas entre o tratamento e os placebos é a BioGaia. Nem os sujeitos do teste nem os pesquisadores têm conhecimento sobre a diferença das pastilhas.

As pastilhas BioGaia Prodentis são um suplemento alimentar para a saúde oral que contém a bactéria ácido láctica patenteada Limosilactobacillus reuteri (anteriormente conhecida como Lactobacillus reuteri) Prodentis (uma combinação de cepas de L. reuteri DSM 17938 e L. reuteriATCC PTA 5289) que ajuda os microrganismos bons a manter uma equilíbrio natural na boca. Este produto é seguro para uso diário e o produto pode ser usado durante a gravidez e amamentação. Ingredientes deste produto: agente de volume (isomalte), L. reuteri DSM 17938 e L. reuteri ATCC PTA 5289, óleo de palma totalmente hidrogenado, aroma de menta, aroma de mentol, óleo de menta e edulcorante (sucralose). Uma pastilha consiste em um mínimo de 200 milhões de L. reuteriProdentis vivos. Peso líquido por pastilha, 800 mg. O consumo excessivo pode ter efeitos laxantes devido ao conteúdo de edulcorantes no produto.

Assunto de pesquisa:

A fim de avaliar sua eficácia clínica, as pastilhas contendo probiótico L. reuteri serão utilizadas para os pacientes submetidos à terapia ortodôntica fixa, conforme descrito anteriormente no estudo piloto. Será realizado um ensaio controlado randomizado usando um design paralelo com 21 indivíduos no grupo de teste e 21 indivíduos no grupo de controle. O cálculo do tamanho da amostra foi realizado assumindo que o grupo controle não terá alteração nos patógenos orais enquanto o grupo teste terá uma redução observada no estudo piloto. Considerando o teste bilateral com nível de significância de 0,05 e poder de 80% para detectar tais diferenças entre os dois grupos, seriam necessários 21 sujeitos em cada grupo.

Os sujeitos são alunos voluntários ou pacientes da Faculdade de Odontologia da Universidade Trisakti, submetidos a tratamento ortodôntico com aparelho fixo, com os seguintes critérios de inclusão: idade de 18 a 28 anos de ambos os sexos; em tratamento ortodôntico com aparelho fixo há um ano; sem consumo de probióticos (mín. 3 meses antes); sem consumo de medicamento como antibiótico (min 3 meses antes) e PBI Score >1. Os critérios de exclusão são sujeitos com doenças sistêmicas e alérgicos a probióticos. Os sujeitos foram recrutados por um aluno de pós-graduação que fazia parte da equipe de pesquisa. Os candidatos relutantes ou indispostos podem recusar diretamente o convite de recrutamento de todo o coração, portanto, os voluntários que foram recrutados concordaram de todo o coração em se tornar sujeitos de teste desta pesquisa. Os indivíduos recrutados serão então designados aleatoriamente para o teste.

O tempo para coleta de 3 amostras foi realizado em aproximadamente 15 minutos. A amostragem será realizada na clínica executiva da Faculdade de Odontologia, Trisakti University Dental Hospital. Os participantes receberão creme dental e escova de dentes durante o período de estudo e os indivíduos precisam escovar os dentes duas vezes por dia. O consumo de probióticos será feito 2 semanas após o controle ortodôntico. As amostras serão coletadas duas vezes: no primeiro dia (antes de consumir pastilhas) e no 14º dia após o sujeito consumir pastilhas contendo o probiótico L. reuteri. Os probióticos são tomados uma vez ao dia durante duas semanas após o café da manhã e escovar os dentes.

Métodos de coleta de amostras Antes da coleta de amostras, primeiro foi confirmado que todos os indivíduos foram submetidos ao teste rápido de antígeno para detecção de SARS-CoV2 devido à atual pandemia de Covid-19 (30 de setembro de 2020), na qual o resultado do teste deve ser um resultado negativo para todos os pacientes. O resultado negativo indica que o sujeito não teve infecção anterior por SARS-CoV2. Após a confirmação, amostras de amostras dos indivíduos no período mínimo de duas semanas após o controle ortodôntico, foram coletadas por um dentista / médico especialista equipado com um conjunto completo de equipamentos de proteção individual.

A amostra de saliva é coletada usando o método de drenagem. O sujeito é levado a sentar-se calmamente enquanto inclina a cabeça para baixo e abre a boca para permitir que a saliva goteje passivamente do lábio inferior. A saliva é coletada usando tubos estéreis e pré-pesados. Os sujeitos devem estar em jejum / duas horas após o café da manhã. Os indivíduos não devem escovar os dentes por no mínimo 45 minutos antes da coleta de amostras de saliva. Após a coleta de saliva, recomenda-se armazenar as amostras de saliva a -20oC, caso a análise não seja feita imediatamente. Além disso, é melhor aliquotar e congelar as amostras em vários tubos para evitar ciclos de congelamento e descongelamento que possam degradar a qualidade da saliva.

A amostra de placa é coletada esfregando todas as superfícies (vestibular/mesial/distal/lingual/oclusal) do primeiro molar permanente individual usando um palito estéril. A amostra de placa foi então transferida para uma solução salina tamponada com fosfato (PBS) estéril. Após a coleta, a amostra de placa é armazenada a -20oC até que novas análises sejam feitas.

A amostra de fluido crevicular gengival (GCF) é coletada usando a técnica de tira de papel absorvente. Uma tira de papel absorvente é colocada suavemente em vários locais selecionados. A tira é removida após sentir resistência à luz, aproximadamente após ser deixada por 30 segundos. Várias tiras de papel para um indivíduo são agrupadas em vários tubos de microcentrífuga de 1,5 ml contendo 100 µl de PBS a 4oC. Os tubos foram posteriormente armazenados a -20oC e utilizados para análise posterior.

Parte I: Ensaio clínico para avaliar a eficácia do probiótico na resposta inflamatória gengival de pacientes ortodônticos usando o método ELISA.

A fim de avaliar sua eficácia clínica, as pastilhas probióticas contendo L. reuteri serão utilizadas para os pacientes submetidos à terapia ortodôntica fixa, conforme descrito anteriormente no estudo piloto. Os indivíduos do grupo de teste receberão duas semanas de consumo diário das pastilhas probióticas administradas (2x108 CFU/comprimido) após o café da manhã e escovação dos dentes. Amostras serão coletadas de todos os indivíduos no dia um e dia quatorze. As amostras de fluido crevicular gengival, saliva e placa dentária serão coletadas dos indivíduos recrutados antes da alocação do grupo usando metodologia padrão conforme descrito anteriormente [30]. As amostras coletadas serão armazenadas em caixa térmica e colocadas em geladeira de laboratório a -80°C. As amostras serão utilizadas para análise dos níveis de Interleucina 1-beta, Interleucina 6, Interleucina 8, Interleucina 10, TNF alfa, MMP-9 e RANKL pelo método ELISA (BioLegend, San Diego, EUA).

Parte II: Ensaio clínico para avaliar o efeito probiótico no microbioma oral metagenômico em pacientes ortodônticos usando NGS Saliva e amostra de placa serão coletadas de cada grupo. Os investigadores farão o perfil do microbioma para 40 amostras de cada execução de sequenciamento. O DNA bacteriano e fúngico das amostras coletadas será extraído usando o MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit ou Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit. O método de extração seguirá o protocolo de fabricação do kit. O DNA extraído será submetido à verificação de qualidade usando Nanodrop. A concentração de gDNA será medida usando o fluorômetro Qubit. A concentração recomendada de gDNA de cada amostra é de 5 ng/uL. Após controle de qualidade, as regiões V3-V4 do gene 16S e 18S rRNA de cada amostra serão amplificadas por PCR. Durante a preparação da biblioteca, os amplicons gerados serão convertidos em biblioteca usando o Nextera XT Index Kit (Illumina, EUA) de acordo com as instruções do fabricante. Todas as bibliotecas resultantes serão avaliadas usando o fluorômetro Qubit e serão sequenciadas usando a plataforma iSeq 100 (Illumina, EUA). O parâmetro de sequenciamento será de 300 ciclos com pico de controle PhiX de 5%. Os dados de perfil microbiano visualizados da execução da sequência podem ser visualizados usando o software Illumina Local Run Manager.