Vliv konzumace probiotického Lactobacillus Reuteri Prodentis na zánětlivou odpověď gingivální crevikulární tekutiny a metagenomické profily orálního mikrobiomu u ortodontických pacientů.

Zdůvodnění a pozadí studie

Estetika je primárním hlediskem pro pacienty hledající ortodontickou léčbu. Kromě estetických aspektů však chybné postavení zubů může také způsobovat zdravotní problémy ovlivňující orální funkce, jako je žvýkání, řeč a psychosociální problémy v důsledku zhoršené dentofaciální estetiky. Proto se subjekty podstupující fixní ortodontickou léčbu mohou setkat s několika problémy souvisejícími s ústním zdravím. Je známo, že fixní ortodontická léčba vystavuje subjekt riziku akumulace těžkého zubního plaku, který mění symbiotický ekosystém orálního mikrobiomu. To vede k dysbiotickému orálnímu mikrobiomu, který obsahuje více patogenních druhů. Bylo prokázáno, že patogenní S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans a C. albicans jsou přítomny u ortodontických pacientů, kteří nevěnují dostatečnou pozornost postupům ústní hygieny.

S. mutans je fakultativní anaerobní grampozitivní orální bakterie, která hraje důležitou roli při vzniku zubního kazu. P. gingivalis a A. actinomycetemcomitans jsou anaerobní gramnegativní orální bakterie spojené s periodontitidou. Údaje z The National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III) naznačují, že 14 % ortodontických pacientů v USA starších 20 let má středně těžkou až těžkou parodontitidu. Navíc byla prokázána přítomnost a patogenní potenciál C. albicans v parodontální kapse těchto pacientů. C. albicans je robustní organismus tvořící biofilm, který představuje terapeutickou komplikaci.

L. reuteri je komenzální orální probiotická bakterie, o které je známo, že produkuje antibakteriální sloučeninu, reuterin. Struktura tohoto širokospektrého antimikrobiální látky souvisí s hydroxypropionaldehydem, který vzniká při fermentaci s glycerolem. Předchozí studie prokázaly příznivý účinek reuterinu proti patogenním ústním bakteriím. Kromě toho je bezpečný pro použití jako žvýkačky nebo jogurty. Kromě toho předchozí studie zjistila, že žvýkačka obsahující L. reuteri byla účinná při snižování hromadění plaku a zánětu dásní u pacientů se středně těžkou až těžkou gingivitidou. Žvýkačka obsahující L. reuteri má tedy značné důkazy pro použití pro zlepšení zdraví ústní dutiny.

Předběžné údaje: V rámci pilotní studie výzkumníci odebrali vzorky slin od osmi ortodontických pacientů (průměrný věk 21 let) před a dva týdny po každodenní konzumaci probiotik. Od každého subjektu byl odebrán duplicitní vzorek. Výsledky ukázaly významné snížení S. mutans sérotypu c, S. mutans sérotypu d, P. gingivalis a A. aktinomycetemcomitans po konzumaci probiotik (p<0,05).

Mezera ve výzkumu: Schopnost L. reuteri modulovat zánětlivou odpověď viz. Interleukin 1 beta, Interleukin 6, interleukin 8, interleukin 10, TNF alfa, MMP-9 a RANKL a vliv na profil orálního metagenomického mikrobiomu u pacientů podstupujících ortodontickou léčbu nebyl dosud zkoumán.

Materiály a metody

Pastilky Lactobacillus reuteri Prodentis spolu s placebem pro srovnání byly odeslány z BioGaia, Stockholm, Švédsko. Dvojitě zaslepené číslování pastilek bylo provedeno před odesláním pro výzkumníky, aby se předešlo zkreslení, takže jedinou stranou, která má informace týkající se rozdílu pastilek mezi léčbou a placebem, je BioGaia. Testované subjekty ani výzkumníci nemají znalosti o rozdílech v pastilkách.

BioGaia Prodentis pastilky jsou doplněk stravy pro zdraví ústní dutiny obsahující patentovanou bakterii mléčného kvašení Limosilactobacillus reuteri (dříve známou jako Lactobacillus reuteri) Prodentis (kombinace kmenů L. reuteri DSM 17938 a L. reuteriATCC PTA 5289), která pomáhá udržovat dobré mikroorganismy. přirozená rovnováha v ústech. Tento produkt je bezpečný pro každodenní použití a produkt lze používat během těhotenství a kojení. Složení tohoto produktu: plnidlo (isomalt), L. reuteri DSM 17938 a L. reuteri ATCC PTA 5289, plně hydrogenovaný palmový olej, mátové aroma, mentolové aroma, mátový olej a sladidlo (sukralóza). Jedna pastilka obsahuje minimálně 200 milionů živých L. reuteriProdentis. Čistá hmotnost na pastilku, 800 mg. Nadměrná konzumace může mít projímavé účinky kvůli obsahu sladidel ve výrobku.

Předmět výzkumu:

Za účelem vyhodnocení jeho klinické účinnosti budou pastilky obsahující probiotické L. reuteri použity u pacientů podstupujících fixní ortodontickou terapii, jak bylo dříve popsáno v pilotní studii. Bude provedena randomizovaná kontrolovaná studie využívající paralelní design s 21 subjekty v testovací skupině a 21 subjekty v kontrolní skupině. Výpočet velikosti vzorku byl proveden za předpokladu, že kontrolní skupina nebude mít žádnou změnu v orálních patogenech, zatímco testovací skupina bude mít snížení pozorované v pilotní studii. Vezmeme-li v úvahu 2stranný test s hladinou významnosti 0,05 a 80% silou při detekci takových rozdílů mezi dvěma skupinami, bylo by zapotřebí 21 subjektů v každé skupině.

Subjekty jsou studenti dobrovolníci nebo pacienti Fakulty zubního lékařství Trisakti University, podstupující ortodontickou léčbu fixním aparátem, s následujícími kritérii zařazení: věk 18-28 let obou pohlaví; absolvování ortodontické léčby fixním aparátem v posledním roce; žádná konzumace probiotik (min. 3 měsíce předem); žádná spotřeba léků jako antibiotika (min. 3 měsíce předtím) a skóre PBI >1. Kritéria vylučování jsou předmětem systémových onemocnění a alergie na probiotika. Subjekty byly rekrutovány podstupujícím postgraduálním studentem, který byl součástí výzkumného týmu. Uchazeči, kteří se zdráhají nebo nechtějí, mohou pozvání k náboru přímo odmítnout, a proto dobrovolníci, kteří byli přijati, souhlasili s tím, že se stanou testovacími subjekty tohoto výzkumu. Získané subjekty budou následně náhodně zařazeny do testu.

Doba pro odběr 3 vzorků byla přibližně 15 minut. Odběr vzorků bude proveden na výkonné klinice Fakulty zubního lékařství Fakultní zubní nemocnice Trisakti. Účastníci dostanou během studie zubní pastu a zubní kartáček a subjekty si musí čistit zuby dvakrát denně. Konzumace probiotik bude provedena 2 týdny po ortodontické kontrole. Vzorky budou odebírány dvakrát: první den (před konzumací pastilek) a 14. den poté, co subjekt konzumoval pastilky obsahující probiotikum L. reuteri. Probiotika se užívají jednou denně po dobu dvou týdnů po snídani a čištění zubů.

Metody odběru vzorků Před odběrem vzorků bylo nejprve potvrzeno, že každý subjekt prošel rychlým testem antigenu na detekci SARS-CoV2 kvůli současné pandemii Covid-19 (30. září 2020), ve které musí být výsledek testu negativní výsledek u každého pacienta. Negativní výsledek ukazuje, že subjekt nemá v minulosti žádnou infekci SARS-CoV2. Po potvrzení byl vzorek vzorku od subjektů během minimálně dvoutýdenního období po ortodontické kontrole odebrán zubním lékařem / odborným lékařem vybaveným kompletní sadou osobních ochranných prostředků.

Vzorek slin se odebírá metodou odvodnění. Subjekt je nucen tiše sedět a přitom skloňovat hlavu a otevřít ústa, aby sliny pasivně odkapávaly ze spodního rtu. Sliny se odebírají pomocí sterilních, předem zvážených zkumavek. Subjekty by měly být nalačno / dvě hodiny po snídani. Subjekty by si neměly čistit zuby minimálně 45 minut před odběrem vzorků slin. Po odběru slin se doporučuje uchovávat vzorky slin při -20oC, pokud není analýza provedena okamžitě. Navíc je lepší vzorky alikvotovat a zmrazit v několika zkumavkách, aby se zabránilo cyklům zmrazování a rozmrazování, které by mohly zhoršit kvalitu slin.

Vzorek plaku se odebírá setřením všech (bukálních/meziálních/distálních/lingválních/okluzních) povrchů individuálního stálého prvního moláru za použití sterilního párátka. Vzorek plaku byl poté přenesen do sterilního fyziologického roztoku pufrovaného fosfátem (PBS). Po odběru se vzorek plaku skladuje při -20 °C až do provedení další analýzy.

Vzorek gingivální krevikulární tekutiny (GCF) se odebírá technikou absorpčního papírového proužku. Na několik vybraných míst se jemně přiloží proužek savého papíru. Proužek se odstraní poté, co ucítíte lehký odpor, přibližně po 30 sekundách. Více papírových proužků pro jeden subjekt je spojeno do několika 1,5 ml mikrocentrifugační zkumavky obsahující 100 ul PBS při 4 °C. Zkumavky byly následně skladovány při -20oC a použity pro další analýzu.

Část I: Klinická studie k hodnocení účinnosti probiotik na zánětlivou odpověď dásní u ortodontických pacientů metodou ELISA.

Aby se vyhodnotila klinická účinnost, probiotické pastilky obsahující L. reuteri budou použity u pacientů podstupujících fixní ortodontickou terapii, jak bylo dříve popsáno v pilotní studii. Subjektům v testovací skupině budou podávány dva týdny denní konzumace podávaných probiotických pastilek (2x108 CFU/tableta) po snídani a čištění zubů. Vzorky budou odebírány od všech subjektů první a čtrnáctý den. Vzorky gingivální štěrbinové tekutiny, slin a zubního plaku budou odebrány z rekrutovaných subjektů před rozdělením do skupin pomocí standardní metodologie, jak bylo popsáno dříve [30]. Odebrané vzorky budou uloženy v chladicím boxu a umístěny v laboratorní lednici při -80°C. Vzorky budou použity k analýze hladin interleukinu 1-beta, interleukinu 6, interleukinu 8, interleukinu 10, TNF alfa, MMP-9 a RANKL pomocí metody ELISA (BioLegend, San Diego, USA).

Část II: Klinická studie k hodnocení probiotického účinku na metagenomický orální mikrobiom u ortodontických pacientů s použitím NGS Vzorek slin a plaku bude odebrán z každé skupiny. Vyšetřovatelé provedou profilování mikrobiomu pro 40 vzorků v každém běhu sekvenování. Bakteriální a plísňová DNA odebraných vzorků bude extrahována pomocí MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit nebo Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit. Metoda extrakce se bude řídit výrobním protokolem soupravy. Extrahovaná DNA bude podrobena kontrole kvality pomocí Nanodropu. Koncentrace gDNA bude měřena pomocí Qubit fluorometru. Doporučená koncentrace gDNA z každého vzorku je 5 ng/ul. Po kontrole kvality budou oblasti V3-V4 genu 16S a 18S rRNA každého vzorku amplifikovány pomocí PCR. Během přípravy knihovny budou získané amplikony převedeny na knihovnu pomocí Nextera XT Index Kit (Illumina, USA) podle pokynů výrobce. Všechny výsledné knihovny budou vyhodnoceny pomocí fluorometru Qubit a budou sekvenovány pomocí platformy iSeq 100 (Illumina, USA). Parametr sekvenování bude 300 cyklů s kontrolním spike-in PhiX 5%. Vizualizovaná data mikrobiálního profilování ze sekvenčního běhu lze zobrazit pomocí softwaru Illumina Local Run Manager.