Effekten af ​​probiotisk Lactobacillus Reuteri Prodentis-forbrug på tandkøds-crevikulær væske-inflammatorisk respons og metagenomiske profiler af oralt mikrobiom hos ortodontiske patienter.

Begrundelse og baggrund for undersøgelsen

Æstetik er en primær overvejelse for patienter, der søger ortodontisk behandling. Bortset fra æstetiske aspekter kan fejljustering af tænder dog også forårsage sundhedsproblemer, der påvirker oral funktion, såsom tygning, tale og psykosociale problemer på grund af nedsat dentofaciale æstetik. Derfor kan de emner, der gennemgår fast ortodontisk behandling, støde på flere orale sundhedsrelaterede problemer. Den faste ortodontiske behandling er kendt for at placere individet i risiko for ophobning af tung tandplak, som ændrer det symbiotiske økosystem i oralt mikrobiom. Dette fører til dysbiotisk oral mikrobiom, som rummer flere patogene arter. Det har vist sig, at patogene S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans og C. albicans er til stede hos ortodontiske patienter, som ikke er opmærksomme nok på mundhygiejneprocedurer.

S. mutans er en fakultativ anaerob Gram-positiv oral bakterie, der har en vigtig rolle i udviklingen af ​​dental caries. P. gingivalis og A. actinomycetemcomitans er en anaerob gramnegativ oral bakterie forbundet med paradentose. Data fra National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III) tyder på, at 14 % ortodontiske patienter i USA over 20 år har moderat til svær paradentose. Desuden er tilstedeværelse og patogent potentiale af C. albicans i periodontal lomme hos disse patienter blevet vist. C. albicans er en robust biofilmdannende organisme, der frembyder terapeutisk komplikation.

L. reuteri er en kommensal oral probiotisk bakterie, som er kendt for at producere en antibakteriel forbindelse, reuterin. Strukturen af ​​dette bredspektrede antimikrobielle middel er relateret til hydroxypropionaldehyd, som dannes under fermentering med glycerol. Tidligere undersøgelser har vist gavnlig effekt af reuterin mod patogene orale bakterier. Desuden er det sikkert at bruge som tyggegummi eller yoghurt. Desuden fandt tidligere undersøgelse, at L. reuteri-holdigt tyggegummi var effektivt til at reducere plakakkumulering og tandkødsbetændelse hos patienter med moderat til svær tandkødsbetændelse. Derfor har L. reuteri-holdigt tyggegummi betydelig evidens for at blive brugt til forbedring af oral sundhed.

Foreløbige data: Som et pilotstudie indsamlede efterforskerne spytprøver fra otte ortodontiske patienter (gennemsnitsalder 21 år) før og to uger efter dagligt probiotikaforbrug. En duplikatprøve blev indsamlet fra hvert individ. Resultaterne viste signifikante reduktioner i S. mutans serotype c, S. mutans serotype d, P. gingivalis og A. actinomycetemcomitans efter probiotisk indtagelse (p<0,05).

Forskningsgab: L. reuteris evne til at modulere det inflammatoriske respons, dvs. Interleukin 1 beta, Interleukin 6, interleukin 8, interleukin 10, TNF alpha, MMP-9 og RANKL og effekt på oral metagenomisk mikrobiomprofil hos patienter, der gennemgår ortodontisk behandling, er ikke tidligere blevet undersøgt.

Materialer og metoder

Lactobacillus reuteri Prodentis pastiller, langs placebos til sammenligning, blev sendt fra BioGaia, Stockholm, Sverige. Dobbeltblindet nummerering af sugetabletterne blev foretaget før forsendelsen for forskerne for at forhindre bias, og derfor er den eneste part, der har information om pastillerforskellen mellem behandling og placebo, BioGaia. Hverken testpersonerne eller forskerne har viden om pastillerforskellen.

BioGaia Prodentis sugetabletter er et kosttilskud til oral sundhed indeholdende den patenterede mælkesyrebakterie Limosilactobacillus reuteri (tidligere kendt som Lactobacillus reuteri) Prodentis (en stammekombination af L. reuteri DSM 17938 og L. reuteriATCC PTA 5289), der hjælper med at holde en god mikroorganisme naturlig balance i munden. Dette produkt er sikkert til daglig brug, og produktet kan bruges under graviditet og amning. Ingredienser i dette produkt: fyldstof (isomalt), L. reuteri DSM 17938 og L. reuteri ATCC PTA 5289, fuldt hydrogeneret palmeolie, pebermyntesmag, mentolsmag, pebermynteolie og sødemiddel (sucralose). En sugetablet består af minimum 200 millioner levende L. reuteriProdentis. Nettovægt pr. sugetablet, 800 mg. Overdreven indtagelse kan have afførende virkning på grund af indholdet af sødestoffer i produktet.

Forskningsemne:

For at vurdere dens kliniske effekt, vil de probiotiske L. reuteri-holdige sugetabletter blive brugt til de patienter, der gennemgår fast ortodontisk terapi som tidligere beskrevet i pilotstudiet. Et randomiseret kontrolleret forsøg med et parallelt design med 21 forsøgspersoner i testgruppen og 21 forsøgspersoner i kontrolgruppen vil blive udført. Prøvestørrelsesberegningen blev udført ved at antage, at kontrolgruppen ikke vil have nogen ændring i de orale patogener, mens testgruppen vil have en reduktion observeret i pilotundersøgelsen. I betragtning af den 2-sidede test med et signifikansniveau på 0,05 og 80 % kraft til at påvise sådanne forskelle mellem de to grupper, kræves der 21 forsøgspersoner i hver gruppe.

Emner er frivillige studerende eller patienter fra Det Odontologiske Fakultet, Trisakti University, der gennemgår ortodontisk behandling med fast apparat, med følgende inklusionskriterier: alder på 18-28 af begge køn; gennemgår ortodontisk behandling med fast apparat i det sidste år; ingen indtagelse af probiotika (min. 3 måneder før); intet forbrug af medicin såsom antibiotika (min. 3 måneder før) og PBI Score >1. Eksklusionskriterierne er underlagt systemiske sygdomme og allergiske over for probiotika. Emner blev rekrutteret af en undergående kandidatstuderende, der var en del af forskerholdet. Fagkandidater, der er tilbageholdende eller uvillige, kan direkte afslå rekrutteringsinvitationen helhjertet, derfor gik de frivillige, der blev rekrutteret, helhjertet med til at blive testpersoner i denne forskning. De rekrutterede forsøgspersoner vil derefter blive tilfældigt tildelt testen.

Tiden for 3 prøvetagning blev udført ca. 15 minutter. Prøveudtagningen vil blive udført på den udøvende klinik på Det Odontologiske Fakultet, Trisakti University Dental Hospital. Deltagerne får udleveret tandpasta og tandbørste i løbet af undersøgelsesperioden, og forsøgspersonerne skal børste deres tænder to gange om dagen. Indtagelse af probiotika vil ske 2 uger efter ortodontikontrol. Prøver vil blive indsamlet to gange: på den første dag (før indtagelse af sugetabletter) og den 14. dag efter forsøgspersonen indtog pastiller indeholdende det probiotiske L. reuteri. Probiotika tages en gang om dagen i to uger efter morgenmad og tandbørstning.

Prøveindsamlingsmetoder Forud for prøvetagning blev det først bekræftet, at alle forsøgspersoner har gennemgået hurtig antigentest for SARS-CoV2-detektion på grund af den aktuelle Covid-19-pandemi (30. september 2020), hvor resultatet af testen skal være en negativt resultat for hver patient. Negativt resultat indikerer, at forsøgspersonen ikke har tidligere infektion med SARS-CoV2. Efter bekræftelse blev prøveprøver fra forsøgspersonerne inden for en periode på minimum to uger efter ortodontikontrol indsamlet af en tandlæge/lægespecialist udstyret med et komplet sæt personlige værnemidler.

Spytprøven opsamles ved hjælp af dræningsmetoden. Personen er lavet til at sidde stille, mens han bøjer hovedet og åbnede munden for at tillade spyttet at dryppe passivt fra underlæben. Spyt opsamles ved hjælp af sterile, præ-vægtede rør. Forsøgspersoner bør være i fastende tilstand / to timer efter morgenmad. Forsøgspersoner bør ikke børste deres tænder i mindst 45 minutter før spytprøvetagning. Efter spytopsamling anbefales det at opbevare spytprøverne ved -20oC, hvis analysen ikke foretages med det samme. Derudover er det bedre at alikvotere og fryse prøver i flere rør for at undgå fryse-tø-cyklusser, der kan forringe spytkvaliteten.

Plakprøven opsamles ved at tørre alle (bukkale/mesiale/distale/linguale/okklusive) overflader af den individuelle permanente første kindtand med en steril tandstik. Plakprøve blev derefter overført til et sterilt phosphatpufret saltvand (PBS). Efter opsamling opbevares plakprøve ved -20oC, indtil yderligere analyse skal udføres.

Gingival crevicular fluid (GCF) prøve opsamles ved brug af absorberende papirstrimmelteknik. En absorberende papirstrimmel anbringes forsigtigt på et udvalgt sted. Strimlen fjernes efter let modstand mærkes, cirka efter at have stået i 30 sekunder. Flere papirstrimler til ét emne samles i flere 1,5 ml mikrocentrifugerør indeholdende 100 µl PBS ved 4oC. Rørene blev efterfølgende opbevaret ved -20oC og brugt til yderligere analyse.

Del I: Klinisk forsøg til evaluering af effektiviteten af ​​probiotika på gingival inflammatorisk respons hos ortodontiske patienter ved hjælp af ELISA-metoden.

For at vurdere dens kliniske effekt, vil de probiotiske, L. reuteri-holdige sugetabletter blive brugt til de patienter, der gennemgår fast ortodontisk terapi som tidligere beskrevet i pilotstudiet. Forsøgspersonerne i testgruppen vil få to ugers daglig indtagelse af de probiotiske sugetabletter administreret (2x108 CFU/tablet) efter morgenmad og tandbørstning. Der vil blive indsamlet prøver fra alle forsøgspersonerne på dag et og dag fjorten. Gingival crevikulær væske, spyt og tandplakprøver vil blive indsamlet fra de rekrutterede forsøgspersoner før gruppetildelingen ved hjælp af standardmetodologi som tidligere beskrevet [30]. De indsamlede prøver vil blive opbevaret i en køleboks og anbragt i laboratoriekøleskab ved -80°C. Prøverne vil blive brugt til at analysere Interleukin 1-beta, Interleukin 6, interleukin 8, interleukin 10, TNF alpha, MMP-9 og RANKL niveau ved hjælp af ELISA metode (BioLegend, San Diego, USA).

Del II: Klinisk forsøg for at evaluere den probiotiske effekt på metagenomisk oral mikrobiom på ortodontiske patienter, der bruger NGS spyt og plakprøve, vil blive indsamlet fra hver gruppe. Efterforskere vil lave mikrobiomprofilering for 40 prøver hver sekventeringskørsel. Bakterie- og svampe-DNA fra indsamlede prøver vil blive ekstraheret ved hjælp af MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit eller Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit. Ekstraktionsmetoden vil følge sættets fremstillingsprotokol. Ekstraheret DNA vil blive underkastet kvalitetskontrol ved hjælp af Nanodrop. Koncentration af gDNA vil blive målt ved hjælp af Qubit fluorometer. Den anbefalede gDNA-koncentration fra hver prøve er 5 ng/uL. Efter kvalitetskontrol vil V3-V4-regioner af 16S- og 18S-rRNA-genet i hver prøve blive amplificeret ved hjælp af PCR. Under forberedelse af biblioteket vil de opnåede amplikoner blive konverteret til bibliotek ved at bruge Nextera XT Index Kit (Illumina, USA) i overensstemmelse med producentens instruktioner. Alle resulterende biblioteker vil blive evalueret ved hjælp af Qubit fluorometer og vil blive sekventeret ved hjælp af iSeq 100 platform (Illumina, USA). Sekvenseringsparameter vil være 300 cyklusser med PhiX-kontrolspike-in på 5 %. Visualiserede mikrobielle profileringsdata fra sekvenskørslen kan ses ved hjælp af Illumina Local Run Manager-software.