Effekten av probiotisk Lactobacillus Reuteri Prodentis-forbruk på Gingival Crevicular Fluid inflammatorisk respons og metagenomiske profiler av oralt mikrobiom hos ortodontiske pasienter.

Begrunnelse og bakgrunn for studien

Estetikk er en primær vurdering for pasienter som søker kjeveortopedisk behandling. Bortsett fra estetiske aspekter, kan imidlertid feiljustering av tennene også forårsake helseproblemer som påvirker oral funksjon som tygging, tale og psykososiale problemer på grunn av nedsatt dentofacial estetikk. Derfor kan fagene som gjennomgår fast kjeveortopedisk behandling komme over flere orale helserelaterte problemer. Den faste kjeveortopedisk behandlingen er kjent for å sette individet i fare for akkumulering av tungt tannplakk som endrer det symbiotiske økosystemet til oral mikrobiom. Dette fører til dysbiotisk oral mikrobiom som inneholder flere patogene arter. Det er vist at patogene S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans og C. albicans er tilstede hos kjeveortopedisk pasienter som ikke tar nok hensyn til munnhygieneprosedyrer.

S. mutans er en fakultativ anaerob Gram-positiv oral bakterie som har en viktig rolle i utviklingen av tannkaries. P. gingivalis og A. actinomycetemcomitans er en anaerob gramnegativ oral bakterie assosiert med periodontitt. Data fra National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III) antyder at 14 % kjeveortopedisk pasienter i USA over 20 år har moderat til alvorlig periodontitt. Dessuten er tilstedeværelse og patogent potensial av C. albicans i periodontal lomme hos disse pasientene vist. C. albicans er en robust biofilmdannende organisme som presenterer terapeutiske komplikasjoner.

L. reuteri er en kommensal oral probiotisk bakterie, som er kjent for å produsere antibakteriell forbindelse, reuterin. Strukturen til dette bredspektrede antimikrobielle stoffet er relatert til hydroksypropionaldehyd, som dannes under gjæring med glyserol. Tidligere studier har vist gunstig effekt av reuterin mot patogene orale bakterier. Dessuten er det trygt å bruke som tyggegummi eller yoghurt. Videre fant tidligere studie at tannkjøtt som inneholder L. reuteri var effektivt for å redusere plakakkumulering og gingivitt hos pasienter med moderat til alvorlig gingivitt. Derfor har L. reuteri-holdig tyggegummi betydelig bevis som kan brukes til å forbedre munnhelsen.

Foreløpige data: Som en pilotstudie samlet etterforskerne spyttprøver fra åtte kjeveortopedisk pasienter (gjennomsnittsalder 21 år) før og to uker etter daglig inntak av probiotika. En duplikatprøve ble samlet inn fra hvert individ. Resultatene viste signifikante reduksjoner i S. mutans serotype c, S. mutans serotype d, P. gingivalis og A. actinomycetemcomitans etter probiotisk inntak (p<0,05).

Forskningsgap: L. reuteris evne til å modulere den inflammatoriske responsen, dvs. Interleukin 1 beta, Interleukin 6, interleukin 8, interleukin 10, TNF alfa, MMP-9 og RANKL og effekt på oral metagenomisk mikrobiomprofil hos pasienter som gjennomgår kjeveortopedisk behandling er ikke tidligere undersøkt.

Materialer og metoder

Lactobacillus reuteri Prodentis pastiller, langs placeboene for sammenligning, ble sendt fra BioGaia, Stockholm, Sverige. Dobbeltblindet nummerering for pastiller ble gjort før forsendelse for forskerne for å forhindre skjevhet, og dermed er den eneste parten som har informasjon om pastillerforskjellen mellom behandling og placebo BioGaia. Verken testpersonene eller forskerne har kunnskap om pastillerforskjellen.

BioGaia Prodentis sugetabletter er et kosttilskudd for oral helse som inneholder den patenterte melkesyrebakterien Limosilactobacillus reuteri (tidligere kjent som Lactobacillus reuteri) Prodentis (en stammekombinasjon av L. reuteri DSM 17938 og L. reuteriATCC PTA 5289) som bidrar til å holde en god mikroorganisme naturlig balanse i munnen. Dette produktet er trygt for daglig bruk, og produktet kan brukes under graviditet og amming. Ingredienser i denne produkten: bulkmiddel (isomalt), L. reuteri DSM 17938 og L. reuteri ATCC PTA 5289, fullstendig hydrogenert palmeolje, peppermyntesmak, mentolsmak, peppermynteolje og søtningsmiddel (sukralose). En pastill består av minimum 200 millioner levende L. reuteriProdentis. Nettovekt per sugetablett, 800 mg. Overdreven forbruk kan ha avføringseffekt på grunn av innholdet av søtningsmidler i produktet.

Forskningsemne:

For å evaluere dens kliniske effekt, vil de probiotiske L. reuteri-holdige sugetablettene brukes til pasienter som gjennomgår fast kjeveortopedisk terapi som tidligere beskrevet i pilotstudien. En randomisert kontrollert studie med parallell design med 21 forsøkspersoner i testgruppen og 21 forsøkspersoner i kontrollgruppen vil bli gjennomført. Prøvestørrelsesberegningen ble utført ved å anta at kontrollgruppen ikke vil ha noen endring i orale patogener, mens testgruppen vil ha en reduksjon observert i pilotstudien. Tatt i betraktning den 2-sidige testen med et signifikansnivå på 0,05 og 80 % kraft til å oppdage slike forskjeller mellom de to gruppene, vil det være nødvendig med 21 forsøkspersoner i hver gruppe.

Emner er frivillige studenter eller pasienter ved Fakultet for odontologi, Trisakti University, som gjennomgår kjeveortopedisk behandling med fast utstyr, med følgende inklusjonskriterier: alder 18-28 av begge kjønn; gjennomgått kjeveortopedisk behandling med fast apparat det siste året; ingen inntak av probiotika (min. 3 måneder før); ingen forbruk av medisin slik som antibiotika (min. 3 måneder før) og PBI Score >1. Eksklusjonskriteriene er underlagt systemiske sykdommer og allergisk mot probiotika. Emner ble rekruttert av en undergående doktorgradsstudent som var en del av forskerteamet. Fagkandidater som er motvillige eller uvillige kan direkte avslå rekrutteringsinvitasjonen helhjertet, derfor gikk de frivillige som ble rekruttert helhjertet med på å bli testobjekter i denne forskningen. De rekrutterte forsøkspersonene vil deretter bli tilfeldig tildelt testen.

Tiden for 3 prøvetaking ble utført ca. 15 minutter. Prøvetaking vil bli utført ved den utøvende klinikken ved Det odontologiske fakultet, Trisakti University Dental Hospital. Deltakerne vil få tannkrem og tannbørste i løpet av studieperioden, og forsøkspersonene må pusse tennene to ganger om dagen. Inntak av probiotika vil skje 2 uker etter kjeveortopedikontroll. Prøver vil bli tatt to ganger: den første dagen (før inntak av sugetabletter) og den 14. dagen etter at forsøkspersonen inntok pastiller som inneholder det probiotiske L. reuteri. Probiotika tas en gang daglig i to uker etter frokost og tannpuss.

Prøveinnsamlingsmetoder Før prøvetaking ble det først bekreftet at alle forsøkspersoner har gjennomgått rask antigentest for SARS-CoV2-deteksjon på grunn av den nåværende Covid-19-pandemien (30. september 2020), der resultatet av testen må være en negativt resultat for hver pasient. Negativt resultat indikerer at forsøkspersonen ikke har noen tidligere infeksjon av SARS-CoV2. Etter bekreftelse ble prøveprøver fra forsøkspersonene innen en periode på minimum to uker etter kjeveortopedisk kontroll, tatt av en tannlege/medisinsk spesialist utstyrt med et komplett sett med personlig verneutstyr.

Spyttprøven samles ved bruk av dreneringsmetode. Motivet er laget for å sitte stille mens det bøyer seg nedover hodet og åpnet munnen for å la spyttet dryppe passivt fra underleppen. Spytt samles opp ved hjelp av sterile, forhåndsvektede rør. Forsøkspersonene bør være i fastende tilstand / to timer etter frokost. Forsøkspersoner bør ikke pusse tennene i minst 45 minutter før spyttprøvetaking. Etter spyttoppsamling anbefales det å oppbevare spyttprøvene ved -20oC, dersom analysen ikke gjøres umiddelbart. I tillegg er det bedre å alikvotere og fryse prøver i flere rør for å unngå fryse-tine-sykluser som kan forringe spyttkvaliteten.

Plakkprøve tas ved å tørke av alle (bukkale/mesiale/distale/linguale/okkklusale) overflater av den individuelle permanente første molar ved hjelp av en steril tannpirker. Plakkprøve ble deretter overført til et sterilt fosfatbufret saltvann (PBS). Etter innsamling lagres plakkprøve ved -20oC inntil videre analyse skal gjøres.

Gingival crevicular fluid (GCF) prøve samles ved bruk av absorberende papirstrimler. En absorberende papirstrimmel plasseres forsiktig på et utvalgt sted. Stripen fjernes etter at lett motstand merkes, omtrent etter å ha ligget i 30 sekunder. Flere papirstrimler for ett emne samles i flere 1,5 ml mikrosentrifugerør som inneholder 100 µl PBS ved 4oC. Rørene ble deretter lagret ved -20oC og brukt til videre analyse.

Del I: Klinisk studie for å evaluere effekten av probiotika på gingival inflammatorisk respons hos kjeveortopedisk pasienter ved bruk av ELISA-metoden.

For å evaluere dens kliniske effekt, vil de probiotiske, L. reuteri-holdige sugetablettene bli brukt til pasientene som gjennomgår fast kjeveortopedisk terapi som tidligere beskrevet i pilotstudien. Forsøkspersonene i testgruppen vil få to ukers daglig inntak av probiotiske pastiller administrert (2x108 CFU/tablett) etter frokost og tannpuss. Det vil bli samlet inn prøver fra alle fagene på dag én og dag fjorten. Gingival crevikulær væske, spytt og tannplakkprøver vil bli samlet inn fra de rekrutterte forsøkspersonene før gruppetildelingen ved bruk av standardmetodikk som tidligere beskrevet [30]. De innsamlede prøvene vil bli lagret i en kjøleboks og plassert i laboratoriekjøleskap ved -80°C. Prøvene vil bli brukt til å analysere Interleukin 1-beta, Interleukin 6, interleukin 8, interleukin 10, TNF alfa, MMP-9 og RANKL nivå ved bruk av ELISA metode (BioLegend, San Diego, USA).

Del II: Klinisk studie for å evaluere den probiotiske effekten på metagenomisk oral mikrobiom på kjeveortopedisk pasienter som bruker NGS spytt og plakkprøve, vil bli samlet inn fra hver gruppe. Etterforskere vil gjøre mikrobiomprofilering for 40 prøver hver sekvenseringskjøring. Bakterie- og sopp-DNA fra innsamlede prøver vil bli ekstrahert ved hjelp av MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit eller Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit. Ekstraksjonsmetoden vil følge settets produksjonsprotokoll. Ekstrahert DNA vil bli gjenstand for kvalitetssjekk ved bruk av Nanodrop. Konsentrasjonen av gDNA vil bli målt ved å bruke Qubit fluorometer. Den anbefalte gDNA-konsentrasjonen fra hver prøve er 5 ng/uL. Etter kvalitetskontroll vil V3-V4-regioner av 16S- og 18S-rRNA-genene til hver prøve bli amplifisert ved bruk av PCR. Under forberedelse av biblioteket vil de oppnådde amplikonene bli konvertert til bibliotek ved å bruke Nextera XT Index Kit (Illumina, USA) i henhold til produsentens instruksjoner. Alle resulterende biblioteker vil bli evaluert ved å bruke Qubit fluorometer og vil bli sekvensert ved hjelp av iSeq 100-plattformen (Illumina, USA). Sekvenseringsparameter vil være 300 sykluser med PhiX-kontrollspike-in på 5 %. Visualiserte mikrobielle profileringsdata fra sekvenskjøringen kan sees ved hjelp av Illumina Local Run Manager-programvaren.