L'effet de la consommation de probiotiques Lactobacillus Reuteri Prodentis sur la réponse inflammatoire du liquide créviculaire gingival et les profils métagénomiques du microbiome oral chez les patients orthodontiques.

Raison d'être et contexte de l'étude

L'esthétique est une considération primordiale pour les patients souhaitant un traitement orthodontique. Cependant, outre les aspects esthétiques, le mauvais alignement des dents peut également entraîner des problèmes de santé affectant la fonction buccale tels que la mastication, la parole et des problèmes psychosociaux dus à une altération de l'esthétique dentofaciale. Par conséquent, les sujets subissant un traitement orthodontique fixe peuvent rencontrer plusieurs problèmes liés à la santé bucco-dentaire. Le traitement orthodontique fixe est connu pour exposer le sujet à un risque d'accumulation de plaque dentaire abondante qui altère l'écosystème symbiotique du microbiome buccal. Cela conduit à un microbiote oral dysbiotique qui abrite plus d'espèces pathogènes. Il a été démontré que les pathogènes S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans et C. albicans sont présents chez les patients orthodontiques qui ne prêtent pas suffisamment attention aux procédures d'hygiène bucco-dentaire.

S. mutans est une bactérie buccale anaérobie facultative à Gram positif qui joue un rôle important dans le développement des caries dentaires. P. gingivalis et A. actinomycetemcomitans sont des bactéries buccales anaérobies à Gram négatif associées à la parodontite. Les données de l'enquête nationale sur la santé et la nutrition (NHANES III) suggèrent que 14 % des patients orthodontiques aux États-Unis âgés de plus de 20 ans souffrent de parodontite modérée à sévère. De plus, la présence et le potentiel pathogène de C. albicans dans la poche parodontale de ces patients ont été démontrés. C. albicans est un organisme robuste formant un biofilm, présentant une complication thérapeutique.

L. reuteri est une bactérie probiotique orale commensale, connue pour produire un composé antibactérien, la reutérine. La structure de cet antimicrobien à large spectre est liée à l'hydroxypropionaldéhyde, qui s'est formé lors de la fermentation avec le glycérol. Des études antérieures ont montré l'effet bénéfique de la reutérine contre les bactéries buccales pathogènes. De plus, il peut être utilisé en toute sécurité comme chewing-gums ou yaourts. En outre, une étude précédente a révélé que la gomme contenant L. reuteri était efficace pour réduire l'accumulation de plaque et la gingivite chez les patients atteints de gingivite modérée à sévère. Par conséquent, le chewing-gum contenant L. reuteri a des preuves considérables à utiliser pour l'amélioration de la santé bucco-dentaire.

Données préliminaires : Dans le cadre d'une étude pilote, les chercheurs ont recueilli des échantillons de salive de huit patients orthodontiques (âge moyen 21 ans) avant et deux semaines après la consommation quotidienne de probiotiques. Un échantillon en double a été prélevé sur chaque sujet. Les résultats ont montré des réductions significatives de S. mutans sérotype c, S. mutans sérotype d, P. gingivalis et A. actinomycetemcomitans après consommation de probiotiques (p<0,05).

Lacune de la recherche : La capacité de L. reuteri à moduler la réponse inflammatoire, à savoir. L'interleukine 1 bêta, l'interleukine 6, l'interleukine 8, l'interleukine 10, le TNF alpha, la MMP-9 et le RANKL et l'effet sur le profil du microbiome métagénomique oral chez les patients subissant un traitement orthodontique n'ont pas été étudiés auparavant.

Matériels et méthodes

Les pastilles Lactobacillus reuteri Prodentis, ainsi que les placebos de comparaison, ont été expédiés de BioGaia, Stockholm, Suède. La numérotation en double aveugle des pastilles a été effectuée avant l'expédition pour que les chercheurs évitent les biais. Ainsi, la seule partie qui dispose d'informations concernant la différence des pastilles entre le traitement et les placebos est BioGaia. Ni les sujets de test ni les chercheurs n'ont la connaissance de la différence des pastilles.

Les pastilles BioGaia Prodentis sont un complément alimentaire pour la santé bucco-dentaire contenant la bactérie lactique brevetée Limosilactobacillus reuteri (anciennement connue sous le nom de Lactobacillus reuteri) Prodentis (une combinaison de souches de L. reuteri DSM 17938 et L. reuteriATCC PTA 5289) qui aide les bons micro-organismes à conserver une équilibre naturel en bouche. Ce produit est sans danger pour un usage quotidien et le produit peut être utilisé pendant la grossesse et l'allaitement. Ingrédients de ce produit : agent de charge (isomalt), L. reuteri DSM 17938 et L. reuteri ATCC PTA 5289, huile de palme totalement hydrogénée, arôme menthe poivrée, arôme menthol, huile de menthe poivrée et édulcorant (sucralose). Une pastille contient au minimum 200 millions de L. reuteriProdentis vivants. Poids net par pastille, 800 mg. Une consommation excessive peut avoir des effets laxatifs en raison de la teneur en édulcorants du produit.

Sujet de recherche :

Afin d'évaluer son efficacité clinique, les pastilles probiotiques contenant L. reuteri seront utilisées pour les patients subissant un traitement orthodontique fixe comme décrit précédemment dans l'étude pilote. Un essai contrôlé randomisé utilisant une conception parallèle avec 21 sujets dans le groupe test et 21 sujets dans le groupe témoin sera mené. Le calcul de la taille de l'échantillon a été effectué en supposant que le groupe témoin n'aura aucun changement dans les agents pathogènes oraux tandis que le groupe test aura une réduction observée dans l'étude pilote. Compte tenu du test bilatéral avec un niveau de signification de 0,05 et une puissance de 80 % pour détecter de telles différences entre les deux groupes, 21 sujets dans chaque groupe seraient nécessaires.

Les sujets sont des étudiants volontaires ou des patients de la Faculté de médecine dentaire de l'Université de Trisakti, subissant un traitement orthodontique avec un appareil fixe, avec les critères d'inclusion suivants : âge de 18 à 28 ans de l'un ou l'autre sexe ; suivre un traitement orthodontique avec appareil fixe depuis un an ; pas de consommation de probiotiques (min. 3 mois avant); pas de consommation de médicament tel antibiotique (min 3 mois avant) et score PBI >1. Les critères d'exclusion sont les sujets atteints de maladies systémiques et allergiques aux probiotiques. Les sujets ont été recrutés par un étudiant diplômé faisant partie de l'équipe de recherche. Les candidats sujets qui sont réticents ou réticents peuvent directement refuser l'invitation de recrutement sans réserve, par conséquent, les volontaires qui ont été recrutés sans réserve ont accepté de devenir les sujets de test de cette recherche. Les sujets recrutés seront ensuite assignés au hasard au test.

Le temps de prélèvement de 3 échantillons a été d'environ 15 minutes. L'échantillonnage sera effectué à la clinique exécutive de la faculté de médecine dentaire de l'hôpital dentaire universitaire de Trisakti. Les participants recevront du dentifrice et une brosse à dents pendant la période d'étude et les sujets doivent se brosser les dents deux fois par jour. La consommation de probiotiques se fera 2 semaines après le contrôle orthodontique. Des échantillons seront prélevés deux fois : le premier jour (avant de consommer les pastilles) et le 14e jour après que le sujet ait consommé des pastilles contenant le probiotique L. reuteri. Les probiotiques sont pris une fois par jour pendant deux semaines après le petit-déjeuner et le brossage des dents.

Méthodes de prélèvement des échantillons Avant le prélèvement des échantillons, il a d'abord été confirmé que chaque sujet a subi un test antigénique rapide pour la détection du SRAS-CoV2 en raison de la pandémie actuelle de Covid-19 (30 septembre 2020), dans laquelle le résultat du test doit être un résultat négatif pour chaque patient. Un résultat négatif indique que le sujet n'a pas d'infection antérieure par le SRAS-CoV2. Après confirmation, un échantillon prélevé sur les sujets dans un délai minimum de deux semaines après le contrôle orthodontique a été prélevé par un dentiste/médecin spécialiste équipé d'un ensemble complet d'équipements de protection individuelle.

L'échantillon de salive est recueilli à l'aide d'une méthode de drainage. Le sujet est obligé de s'asseoir tranquillement tout en penchant la tête et en ouvrant la bouche pour permettre à la salive de s'écouler passivement de la lèvre inférieure. La salive est recueillie à l'aide de tubes stériles pré-lestés. Les sujets doivent être à jeun / deux heures après le petit-déjeuner. Les sujets ne doivent pas se brosser les dents pendant au moins 45 minutes avant le prélèvement d'échantillons de salive. Après le prélèvement de salive, il est recommandé de conserver les échantillons de salive à -20oC, si l'analyse n'est pas effectuée immédiatement. De plus, il est préférable d'aliquoter et de congeler les échantillons dans plusieurs tubes pour éviter les cycles de congélation-décongélation qui pourraient dégrader la qualité de la salive.

L'échantillon de plaque est prélevé en frottant toutes les surfaces (buccale/mésiale/distale/linguale/occlusale) de la première molaire permanente individuelle à l'aide d'un cure-dent stérile. L'échantillon de plaque a ensuite été transféré dans une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS). Après le prélèvement, l'échantillon de plaque est stocké à -20 oC jusqu'à ce qu'une analyse plus approfondie soit effectuée.

L'échantillon de liquide créviculaire gingival (GCF) est prélevé à l'aide de la technique de la bande de papier absorbant. Une bande de papier absorbant est délicatement placée sur plusieurs sites sélectionnés. La bande est retirée après avoir ressenti une légère résistance, environ après avoir été laissée pendant 30 secondes. Plusieurs bandes de papier pour un sujet sont regroupées dans plusieurs tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml contenant 100 µl de PBS à 4oC. Les tubes ont ensuite été stockés à -20oC et utilisés pour une analyse plus approfondie.

Partie I : Essai clinique pour évaluer l'efficacité d'un probiotique sur la réponse inflammatoire gingivale de patients orthodontiques en utilisant la méthode ELISA.

Afin d'évaluer son efficacité clinique, les pastilles probiotiques contenant L. reuteri seront utilisées pour les patients subissant un traitement orthodontique fixe comme décrit précédemment dans l'étude pilote. Les sujets du groupe test recevront deux semaines de consommation quotidienne des pastilles probiotiques administrées (2x108 UFC/comprimé) après le petit-déjeuner et le brossage des dents. Des échantillons seront prélevés sur tous les sujets le premier jour et le quatorzième jour. Les échantillons de fluide créviculaire gingival, de salive et de plaque dentaire seront prélevés sur les sujets recrutés avant l'attribution du groupe en utilisant la méthodologie standard décrite précédemment [30]. Les échantillons collectés seront stockés dans une glacière et placés dans un réfrigérateur de laboratoire à -80°C. Les échantillons seront utilisés pour analyser le niveau d'interleukine 1-bêta, d'interleukine 6, d'interleukine 8, d'interleukine 10, de TNF alpha, de MMP-9 et de RANKL en utilisant la méthode ELISA (BioLegend, San Diego, USA).

Partie II : Essai clinique pour évaluer l'effet probiotique sur le microbiome oral métagénomique chez les patients orthodontiques utilisant le NGS Un échantillon de salive et de plaque sera prélevé dans chaque groupe. Les enquêteurs effectueront le profilage du microbiome pour 40 échantillons à chaque cycle de séquençage. L'ADN bactérien et fongique des échantillons collectés sera extrait à l'aide du kit d'isolement d'ADN MoBio PowerSoil® ou du mini kit d'ADN Qiagen QIAamp®. La méthode d'extraction suivra le protocole de fabrication du kit. L'ADN extrait sera soumis à un contrôle de qualité à l'aide de Nanodrop. La concentration d'ADNg sera mesurée à l'aide du fluoromètre Qubit. La concentration d'ADNg recommandée pour chaque échantillon est de 5 ng/uL. Après le contrôle qualité, les régions V3-V4 des gènes d'ARNr 16S et 18S de chaque échantillon seront amplifiées par PCR. Pendant la préparation de la bibliothèque, les amplicons produits seront convertis en bibliothèque à l'aide du kit d'indexation Nextera XT (Illumina, US) conformément aux instructions du fabricant. Toutes les bibliothèques résultantes seront évaluées à l'aide du fluoromètre Qubit et seront séquencées à l'aide de la plate-forme iSeq 100 (Illumina, États-Unis). Le paramètre de séquençage sera de 300 cycles avec un pic de contrôle PhiX de 5 %. Les données de profilage microbien visualisées de l'exécution de la séquence peuvent être visualisées à l'aide du logiciel Illumina Local Run Manager.