Effekten av probiotisk Lactobacillus Reuteri Prodentis-konsumtion på Gingival Crevicular Fluid Inflammatory Response och Metagenomic Profiler of Oral Microbiome hos ortodontiska patienter.

Förklaring och bakgrund till studien

Estetik är en primär faktor för patienter som söker ortodontisk behandling. Bortsett från estetiska aspekter kan dock felaktiga tänder också orsaka hälsoproblem som påverkar munfunktionen, såsom tuggning, tal och psykosociala problem på grund av försämrad dentofacial estetik. Därför kan försökspersoner som genomgår fast ortodontisk behandling stöta på flera munhälsorelaterade problem. Den fasta ortodontiska behandlingen är känd för att utsätta patienten för risk för ackumulering av tungt tandplack som förändrar det symbiotiska ekosystemet för oral mikrobiom. Detta leder till dysbiotisk oral mikrobiom som hyser fler patogena arter. Det har visats att patogena S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans och C. albicans finns hos ortodontiska patienter som inte ägnar tillräcklig uppmärksamhet åt munhygienprocedurer.

S. mutans är en fakultativ anaerob Gram-positiv oral bakterie som har en viktig roll i utvecklingen av tandkaries. P. gingivalis och A. actinomycetemcomitans är en anaerob gramnegativ oral bakterie associerad med parodontit. Data från National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III) tyder på att 14 % ortodontiska patienter i USA över 20 år har måttlig till svår parodontit. Dessutom har närvaro och patogen potential för C. albicans i parodontala ficka hos dessa patienter visats. C. albicans är en robust biofilmbildande organism som uppvisar terapeutiska komplikationer.

L. reuteri är en kommensal oral probiotisk bakterie, som är känd för att producera en antibakteriell förening, reuterin. Strukturen hos denna bredspektrumantimikrobiella substans är relaterad till hydroxipropionaldehyd, som bildas under fermentering med glycerol. Tidigare studier har visat gynnsam effekt av reuterin mot patogena orala bakterier. Dessutom är det säkert att använda som tuggummi eller yoghurt. Dessutom fann tidigare studie att tandköttet innehållande L. reuteri var effektivt för att minska plackackumulering och gingivit hos patienter med måttlig till svår gingivit. Därför har L. reuteri-innehållande tuggummi avsevärda bevis att användas för att förbättra munhälsan.

Preliminära data: Som en pilotstudie samlade utredarna salivprover från åtta ortodontiska patienter (medelålder 21 år) före och två veckor efter daglig probiotikakonsumtion. Ett duplikatprov samlades in från varje individ. Resultaten visade signifikanta minskningar av S. mutans serotyp c, S. mutans serotyp d, P. gingivalis och A. actinomycetemcomitans efter probiotisk konsumtion (p<0,05).

Forskningsgap: L. reuteris förmåga att modulera det inflammatoriska svaret, dvs. Interleukin 1 beta, Interleukin 6, interleukin 8, interleukin 10, TNF alfa, MMP-9 och RANKL och effekt på oral metagenomisk mikrobiomprofil hos patienter som genomgår ortodontisk behandling har inte tidigare undersökts.

Material och metoder

Lactobacillus reuteri Prodentis pastiller, längs placebos för jämförelse, skickades från BioGaia, Stockholm, Sverige. Dubbelblind numrering av sugtabletterna gjordes före leverans för forskarna för att förhindra partiskhet, och därför är BioGaia den enda part som har information om pastillerskillnaden mellan behandling och placebo. Varken testpersonerna eller forskarna har kunskapen om pastillerskillnaden.

BioGaia Prodentis pastiller är ett kosttillskott för munhälsa som innehåller den patenterade mjölksyrabakterien Limosilactobacillus reuteri (tidigare känd som Lactobacillus reuteri) Prodentis (en stamkombination av L. reuteri DSM 17938 och L. reuteriATCC PTA 5289) som hjälper till att hålla en god mikroorganism naturlig balans i munnen. Denna produkt är säker för daglig användning och produkten kan användas under graviditet och amning. Ingredienser i denna produkt: bulkmedel (isomalt), L. reuteri DSM 17938 och L. reuteri ATCC PTA 5289, helt hydrerad palmolja, pepparmintsmak, mentolsmak, pepparmyntsolja och sötningsmedel (sukralos). En pastiller består av minst 200 miljoner levande L. reuteriProdentis. Nettovikt per sugtablett, 800 mg. Överdriven konsumtion kan ha laxerande effekter på grund av innehållet av sötningsmedel i produkten.

Forskningsämne:

För att utvärdera dess kliniska effekt kommer de probiotiska L. reuteri-innehållande sugtabletterna att användas för patienter som genomgår fast ortodontisk behandling som tidigare beskrivits i pilotstudien. En randomiserad kontrollerad studie med en parallell design med 21 försökspersoner i testgruppen och 21 försökspersoner i kontrollgruppen kommer att genomföras. Beräkningen av provstorleken utfördes genom att anta att kontrollgruppen inte kommer att ha någon förändring i de orala patogenerna medan testgruppen kommer att ha en minskning observerad i pilotstudien. Med tanke på det 2-sidiga testet med en signifikansnivå på 0,05 och 80 % kraft för att upptäcka sådana skillnader mellan de två grupperna, skulle 21 försökspersoner i varje grupp krävas.

Ämnen är studentvolontärer eller patienter vid tandläkarfakulteten, Trisakti University, som genomgår ortodontisk behandling med fast apparat, med följande inklusionskriterier: ålder 18-28 av båda könen; genomgått ortodontisk behandling med fast apparat under det senaste året; ingen konsumtion av probiotika (min. 3 månader innan); ingen konsumtion av medicin såsom antibiotika (minst 3 månader innan) och PBI Score >1. Uteslutningskriterierna är föremål för systemiska sjukdomar och allergiska mot probiotika. Ämnen rekryterades av en undergående doktorand som ingick i forskargruppen. Ämneskandidater som är motvilliga eller ovilliga kan direkt tacka nej till rekryteringsinbjudan helhjärtat, därför gick de volontärer som rekryterades helhjärtat med på att bli testpersoner i denna forskning. De rekryterade försökspersonerna kommer sedan att slumpmässigt tilldelas testet.

Tiden för insamling av 3 prover genomfördes cirka 15 minuter. Provtagningen kommer att utföras på kliniken vid Odontologiska fakulteten, Trisakti University Dental Hospital. Deltagarna kommer att få tandkräm och tandborste under studieperioden och försökspersonerna måste borsta tänderna två gånger om dagen. Konsumtion av probiotika kommer att ske 2 veckor efter ortodontikontroll. Prover kommer att samlas in två gånger: den första dagen (före intag av pastiller) och den 14:e dagen efter att patienten konsumerat pastiller som innehåller probiotikan L. reuteri. Probiotika tas en gång om dagen i två veckor efter frukost och tandborstning.

Provtagningsmetoder Före provtagningen bekräftades det först att varje försöksperson har genomgått ett snabbt antigentest för SARS-CoV2-detektering på grund av den nuvarande Covid-19-pandemin (30 september 2020), där resultatet av testet måste vara en negativt resultat för varje patient. Negativt resultat tyder på att patienten inte har någon tidigare infektion av SARS-CoV2. Efter bekräftelse togs prov från försökspersonerna inom en period på minst två veckor efter ortodontikontroll, av en tandläkare/medicinsk specialist utrustad med en komplett uppsättning personlig skyddsutrustning.

Salivprovet samlas in med dräneringsmetod. Försökspersonen är gjord för att sitta tyst medan han böjer ner huvudet och öppnar munnen för att låta saliven droppa passivt från underläppen. Saliv samlas upp med hjälp av sterila, förvägda rör. Försökspersonerna ska vara i fastande tillstånd / två timmar efter frukost. Försökspersoner bör inte borsta tänderna i minst 45 minuter före salivprovtagning. Efter salivuppsamling rekommenderas att salivproverna förvaras vid -20oC, om analysen inte görs omedelbart. Dessutom är det bättre att alikvotera och frysa prover i flera rör för att undvika frys-upptiningscykler som kan försämra salivkvaliteten.

Plackprov tas genom att svabba alla (buckala/mesiala/distala/linguala/ocklusiva) ytor på den individuella permanenta första molaren med en steril tandpetare. Plackprov överfördes sedan till en steril fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Efter insamling förvaras plackprovet vid -20oC tills ytterligare analys ska göras.

Gingival crevicular fluid (GCF) prov samlas in med hjälp av absorberande pappersremsteknik. En absorberande pappersremsa placeras försiktigt på flera utvalda platser. Remsan tas bort efter att lätt motstånd känns, ungefär efter att ha lämnats i 30 sekunder. Flera pappersremsor för en patient slås samman i flera 1,5 ml mikrocentrifugrör innehållande 100 µl PBS vid 4oC. Rören förvarades därefter vid -20oC och användes för vidare analys.

Del I: Klinisk prövning för att utvärdera effektiviteten av probiotika på gingival inflammatorisk respons hos ortodontiska patienter med hjälp av ELISA-metoden.

För att utvärdera dess kliniska effekt kommer de probiotiska, L. reuteri-innehållande sugtabletterna att användas för patienter som genomgår fast ortodontisk terapi som tidigare beskrivits i pilotstudien. Försökspersonerna i testgruppen kommer att ges två veckors daglig konsumtion av de probiotiska sugtabletterna (2x108 CFU/tablett) efter frukost och tandborstning. Prover kommer att samlas in från alla försökspersoner dag ett och dag fjorton. Proverna på tandköttets crevikulära vätska, saliv och tandplack kommer att samlas in från de rekryterade försökspersonerna före grupptilldelningen med hjälp av standardmetod som tidigare beskrivits [30]. De insamlade proverna kommer att förvaras i en kylbox och placeras i laboratoriekylskåp vid -80°C. Proverna kommer att användas för att analysera nivåerna Interleukin 1-beta, Interleukin 6, interleukin 8, interleukin 10, TNF alfa, MMP-9 och RANKL med hjälp av ELISA-metoden (BioLegend, San Diego, USA).

Del II: Klinisk prövning för att utvärdera den probiotiska effekten på metagenomisk oral mikrobiom på ortodontiska patienter som använder NGS Saliv och plackprov kommer att samlas in från varje grupp. Utredarna kommer att göra mikrobiomprofilering för 40 prover varje sekvenseringskörning. Bakterie- och svamp-DNA från insamlade prover kommer att extraheras med MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit eller Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit. Extraktionsmetoden följer kitets tillverkningsprotokoll. Extraherat DNA kommer att genomgå kvalitetskontroll med Nanodrop. Koncentrationen av gDNA kommer att mätas med hjälp av Qubit fluorometer. Den rekommenderade gDNA-koncentrationen från varje prov är 5 ng/uL. Efter kvalitetskontroll kommer V3-V4-regioner av 16S- och 18S-rRNA-genen i varje prov att amplifieras med PCR. Under förberedelse av biblioteket kommer de erhållna amplikonerna att omvandlas till bibliotek med hjälp av Nextera XT Index Kit (Illumina, USA) i enlighet med tillverkarens instruktioner. Alla resulterande bibliotek kommer att utvärderas med hjälp av Qubit fluorometer och kommer att sekvenseras med iSeq 100-plattformen (Illumina, USA). Sekvensparametern kommer att vara 300 cykler med PhiX-kontrollspike-in på 5 %. Visualiserade mikrobiell profileringsdata från sekvenskörningen kan ses med hjälp av programvaran Illumina Local Run Manager.