歯列矯正患者の歯肉溝液炎症反応および口腔マイクロバイオームのメタゲノムプロファイルに対するプロバイオティックなラクトバチルス・ロイテリ・プロデンティスの消費の影響。

研究の根拠と背景

審美性は、矯正治療を希望する患者にとって最も重要な考慮事項です。 しかし、審美的な側面とは別に、歯並びの悪さは、咀嚼、発話などの口腔機能に影響を与える健康上の懸念、および歯の美的感覚の障害による心理社会的問題を引き起こす可能性もあります。 したがって、固定矯正治療を受けている被験者は、いくつかの口腔衛生関連の問題に遭遇する可能性があります。 固定矯正治療は、対象者を口腔マイクロバイオームの共生生態系を変化させる重い歯垢の蓄積のリスクにさらすことが知られています。 これは、より多くの病原性種を抱える口腔微生物叢の異常につながります。 口腔衛生処置に十分な注意を払っていない歯列矯正患者には、病原性 S. mutans、P. gingivalis、A. actinomycetemcomitans、および C. albicans が存在することが示されています。

S. mutans は通性嫌気性グラム陽性口腔細菌であり、齲蝕の発生に重要な役割を果たします。 P. gingivalis および A. actinomycetemcomitans は、歯周炎に関連する嫌気性グラム陰性口腔細菌です。 The National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III) のデータによると、米国では 20 歳以上の歯科矯正患者の 14% が中等度から重度の歯周炎を患っています。 さらに、これらの患者の歯周ポケットにおける C. albicans の存在と病原性の可能性が示されています。 C. albicans は堅牢なバイオ フィルム形成生物であり、治療上の合併症を引き起こします。

L. reuteri は、抗菌化合物であるロイテリンを生成することが知られている共生口腔共生細菌です。 この広域スペクトルの抗菌剤の構造は、グリセロールとの発酵中に形成されるヒドロキシプロピオンアルデヒドに関連しています。 以前の研究では、病原性口腔細菌に対するロイテリンの有益な効果が示されています。 また、チューインガムやヨーグルトとしても安心してお使いいただけます。 さらに、以前の研究では、L. reuteri を含むガムが、中等度から重度の歯肉炎の患者の歯垢の蓄積と歯肉炎を軽減するのに効果的であることがわかりました。 したがって、L. reuteri を含むチューインガムには、口腔の健康を改善するために使用されるかなりの証拠があります。

予備データ: パイロット研究として、研究者は毎日プロバイオティクスを摂取する前と 2 週間後に、8 人の歯列矯正患者 (平均年齢 21 歳) から唾液サンプルを収集しました。 各被験者から複製サンプルが収集されました。 その結果、プロバイオティクス摂取後、S. mutans 血清型 c、S. mutans 血清型 d、P. gingivalis、および A. actinomycetemcomitans が大幅に減少したことが示されました (p<0.05)。

研究ギャップ: 炎症反応の調節における L. reuteri の能力。 インターロイキン 1 ベータ、インターロイキン 6、インターロイキン 8、インターロイキン 10、TNF アルファ、MMP-9、および RANKL と、歯列矯正治療を受けている患者の口腔メタゲノム マイクロバイオーム プロファイルへの影響は、これまで調査されていません。

材料および方法

Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｒｅｕｔｅｒｉ Ｐｒｏｄｅｎｔｉｓロゼンジは、比較のためのプラセボとともに、スウェーデン、ストックホルムのＢｉｏＧａｉａから出荷された。 トローチの二重盲検番号付けは、研究者がバイアスを防ぐために出荷前に行われたため、治療とプラセボの間のトローチの違いに関する情報を持っている唯一の関係者はBioGaia. 被験者も研究者もトローチの違いに関する知識を持っていません。

BioGaia Prodentis トローチは、特許取得済みの乳酸菌 Limosilactobacillus reuteri (以前の Lactobacillus reuteri) Prodentis (L. reuteri DSM 17938 と L. reuteriATCC PTA 5289 の菌株の組み合わせ) を含む口腔の健康のための栄養補助食品です。口の中の自然なバランス。 この製品は毎日使用しても安全で、妊娠中および授乳中にも使用できます。 この製品の成分: 増量剤 (イソマルト)、L. ロイテリ DSM 17938 および L. ロイテリ ATCC PTA 5289、完全硬化パーム油、ペパーミント フレーバー、メントール フレーバー、ペパーミント オイル、および甘味料 (スクラロース)。 1 つのトローチは、最低 2 億個の生きた L. reuteriProdentis で構成されています。 トローチあたりの正味重量、800 mg。 過度の摂取は、製品に含まれる甘味料のために下剤効果をもたらす可能性があります.

研究テーマ:

その臨床効果を評価するために、プロバイオティック L. reuteri を含むトローチ剤を、パイロット研究で以前に説明した固定矯正治療を受けている患者に使用します。 試験群 21 名、対照群 21 名の並行計画によるランダム化比較試験を実施する。 サンプルサイズの計算は、対照グループでは口腔病原体に変化がなく、テストグループではパイロット研究で観察された減少があると仮定して実行されました。 2 つのグループ間のこのような違いを検出する際に 0.05 レベルの有意性と 80% の検出力を持つ両側検定を考慮すると、各グループに 21 人の被験者が必要になります。

被験者は学生ボランティアまたはトリサクティ大学歯学部の患者であり、以下の選択基準で固定器具による矯正治療を受けています。過去 1 年間、固定器具による矯正治療を受けている。プロバイオティクスの摂取なし（最低. 3 か月前); -抗生物質などの薬の消費なし（最低3か月前）およびPBIスコア> 1。 除外基準は、全身性疾患の対象であり、プロバイオティクスにアレルギーがあります。 被験者は、研究チームの一員である大学院生によって募集されました。 気が進まない、または不本意な被験者候補は、募集の招待を直接断ることができます. したがって、募集されたボランティアは、この研究の被験者になることに心から同意しました. 募集された被験者は、ランダムにテストに割り当てられます。

3 サンプルの収集時間は約 15 分でした。 サンプリングは、トリサクティ大学歯科病院の歯学部のエグゼクティブ クリニックで実施されます。 研究期間中、参加者には歯磨き粉と歯ブラシが与えられ、被験者は 1 日 2 回歯を磨く必要があります。 プロバイオティクスの消費は、歯列矯正のコントロールの2週間後に行われます. サンプルは 2 回収集されます: 初日 (トローチを消費する前) と、被験者がプロバイオティック L. ロイテリを含むトローチを消費した 14 日後。 プロバイオティクスは、朝食と歯磨きの後に 1 日 1 回、2 週間摂取します。

サンプル採取方法 サンプル採取の前に、現在の Covid-19 パンデミック (2020 年 9 月 30 日) により、すべての被験者が SARS-CoV2 検出のための迅速抗原検査を受けていることが最初に確認されました。すべての患者の否定的な結果。 陰性の結果は、被験者が過去にSARS-CoV2に感染していないことを示しています。 確認後、歯列矯正管理後最低 2 週間以内に被験者からのサンプル標本が、完全な個人用保護具一式を備えた歯科医/医療専門家によって収集されました。

唾液サンプルは、ドレナージ法を使用して収集されます。 被験体を静かに座らせ、頭を下げて口を開け、下唇から受動的に唾液を垂らします。 唾液は、無菌の事前に重み付けされたチューブを使用して収集されます。 被験者は絶食状態/朝食後2時間である必要があります。 被験者は、唾液採取前に少なくとも 45 分間は歯を磨いてはいけません。 唾液採取後、分析をすぐに行わない場合は、唾液サンプルを -20oC で保存することをお勧めします。 さらに、唾液の質を低下させる可能性のある凍結融解サイクルを避けるために、サンプルをいくつかのチューブに分注して凍結することをお勧めします。

滅菌つまようじを使用して、個々の永久第一大臼歯のすべての（頬側/近心側/遠位側/舌側/咬合側）表面を拭き取ることにより、歯垢サンプルを収集します。 次に、プラークサンプルを滅菌リン酸緩衝生理食塩水（PBS）に移しました。 採取後、さらなる分析が行われるまで、プラークサンプルは-20℃で保存されます。

歯肉溝液 (GCF) サンプルは、吸収紙ストリップ技術を使用して収集されます。 いくつかの選択された部位に吸収性の紙片がそっと置かれます。 光抵抗を感じた後、約30秒放置後、ストリップを剥がします。 1 人の被験者の複数の紙片を、4℃で 100 μl の PBS を含む数本の 1.5 ml マイクロ遠心チューブにプールします。 その後、チューブを-20℃で保存し、さらなる分析に使用しました。

パート I : ELISA 法を使用して歯列矯正患者の歯肉炎症反応に対するプロバイオティクスの有効性を評価するための臨床試験。

その臨床的有効性を評価するために、プロバイオティクス、L. reuteri を含むトローチ剤を、パイロット研究で以前に説明した固定矯正治療を受けている患者に使用します。 試験群の被験者には、朝食と歯磨きの後に投与されるプロバイオティクス トローチ (2x108 CFU/錠剤) を 2 週間毎日摂取してもらいます。 サンプルは、1 日目と 14 日目にすべての被験者から収集されます。 歯肉溝液、唾液、および歯垢のサンプルは、以前に記載された [30] の標準的な方法論を使用して、グループ割り当ての前に募集された被験者から収集されます。 採取したサンプルはクーラーボックスに保管し、-80℃の実験用冷蔵庫に入れます。 サンプルを使用して、ELISA法（BioLegend、サンディエゴ、米国）を使用して、インターロイキン1-ベータ、インターロイキン6、インターロイキン8、インターロイキン10、TNFアルファ、MMP-9、およびRANKLレベルを分析します。

パート II: NGS 唾液とプラーク サンプルを使用して、歯列矯正患者のメタゲノム口腔マイクロバイオームに対するプロバイオティクス効果を評価するための臨床試験が各グループから収集されます。 研究者は、シーケンシング実行ごとに 40 サンプルのマイクロバイオーム プロファイリングを行います。 収集したサンプルの細菌および真菌の DNA は、MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit または Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit を使用して抽出されます。 抽出方法は、キットの製造プロトコルに従います。 抽出された DNA は、Nanodrop を使用して品質チェックを受けます。 gDNA の濃度は、Qubit 蛍光光度計を使用して測定されます。 各サンプルの推奨 gDNA 濃度は 5 ng/uL です。 品質管理に続いて、各サンプルの 16S および 18S rRNA 遺伝子の V3-V4 領域を PCR を使用して増幅します。 ライブラリの準備中に、得られたアンプリコンは、製造元の指示に従って Nextera XT Index Kit (Illumina、US) を使用してライブラリに変換されます。 得られたすべてのライブラリは、Qubit 蛍光光度計を使用して評価され、iSeq 100 プラットフォーム (イルミナ、米国) を使用して配列決定されます。 シーケンス パラメーターは、5% の PhiX コントロール スパイクで 300 サイクルになります。 シーケンスランから可視化された微生物プロファイリングデータは、Illumina Local Run Manager ソフトウェアを使用して表示できます。