L'effetto del consumo di probiotici Lactobacillus Reuteri Prodentis sulla risposta infiammatoria del fluido crevicolare gengivale e sui profili metagenomici del microbioma orale nei pazienti ortodontici.

Motivazione e background dello studio

L'estetica è una considerazione primaria per i pazienti che cercano un trattamento ortodontico. Tuttavia, a parte gli aspetti estetici, il disallineamento dei denti può anche causare problemi di salute che interessano la funzione orale come la masticazione, la parola e problemi psicosociali dovuti a compromissione dell'estetica dentofacciale. Pertanto, i soggetti sottoposti a trattamento ortodontico fisso possono incontrare diversi problemi legati alla salute orale. È noto che il trattamento ortodontico fisso pone il soggetto a rischio di accumulo di placca dentale pesante che altera l'ecosistema simbiotico del microbioma orale. Ciò porta al microbioma orale disbiotico che ospita più specie patogene. È stato dimostrato che i patogeni S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans e C. albicans sono presenti in pazienti ortodontici che non prestano sufficiente attenzione alle procedure di igiene orale.

S. mutans è un batterio orale Gram-positivo anaerobio facoltativo che ha un ruolo importante nello sviluppo della carie dentale. P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans sono batteri orali Gram-negativi anaerobi associati alla parodontite. I dati del National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III) suggeriscono che il 14% dei pazienti ortodontici negli Stati Uniti di età superiore ai 20 anni ha una parodontite da moderata a grave. Inoltre, è stata dimostrata la presenza e il potenziale patogeno di C. albicans nella tasca parodontale di questi pazienti. C. albicans è un robusto organismo che forma biofilm, che presenta complicazioni terapeutiche.

L. reuteri è un batterio probiotico orale commensale, noto per produrre un composto antibatterico, la reuterina. La struttura di questo antimicrobico ad ampio spettro è correlata all'idrossipropionaldeide, che si forma durante la fermentazione con il glicerolo. Precedenti studi hanno dimostrato l'effetto benefico della reuterina contro i batteri orali patogeni. Inoltre, è sicuro da usare come gomme da masticare o yogurt. Inoltre, uno studio precedente ha rilevato che la gomma contenente L. reuteri era efficace nel ridurre l'accumulo di placca e la gengivite nei pazienti con gengivite da moderata a grave. Pertanto, la gomma da masticare contenente L. reuteri ha prove considerevoli da utilizzare per il miglioramento della salute orale.

Dati preliminari: come studio pilota, i ricercatori hanno raccolto campioni di saliva da otto pazienti ortodontici (età media 21 anni) prima e due settimane dopo il consumo quotidiano di probiotici. Un campione duplicato è stato raccolto da ciascun soggetto. I risultati hanno mostrato riduzioni significative di S. mutans sierotipo c, S. mutans sierotipo d, P. gingivalis e A. actinomycetemcomitans dopo il consumo di probiotici (p<0,05).

Lacuna di ricerca: la capacità di L. reuteri nel modulare la risposta infiammatoria vale a dire. Interleuchina 1 beta, interleuchina 6, interleuchina 8, interleuchina 10, TNF alfa, MMP-9 e RANKL e l'effetto sul profilo del microbioma metagenomico orale nei pazienti sottoposti a trattamento ortodontico non è stato precedentemente studiato.

Materiali e metodi

Le pastiglie di Lactobacillus reuteri Prodentis, insieme ai placebo per il confronto, sono state spedite da BioGaia, Stoccolma, Svezia. La numerazione in doppio cieco per le losanghe è stata effettuata prima della spedizione per i ricercatori per evitare pregiudizi, quindi l'unica parte che ha informazioni sulla differenza delle losanghe tra il trattamento e il placebo è BioGaia. Né i soggetti del test né i ricercatori sono a conoscenza della differenza tra le losanghe.

BioGaia Prodentis pastiglie è un integratore alimentare per la salute orale contenente il batterio dell'acido lattico brevettato Limosilactobacillus reuteri (precedentemente noto come Lactobacillus reuteri) Prodentis (una combinazione di ceppi di L. reuteri DSM 17938 e L. reuteriATCC PTA 5289) che aiuta i microrganismi buoni a mantenere un equilibrio naturale in bocca. Questo prodotto è sicuro per l'uso quotidiano e il prodotto può essere utilizzato durante la gravidanza e l'allattamento. Ingredienti di questo prodotto: agente di carica (isomalto), L. reuteri DSM 17938 e L. reuteri ATCC PTA 5289, olio di palma completamente idrogenato, aroma di menta piperita, aroma di mentolo, olio di menta piperita e dolcificante (sucralosio). Una pastiglia è composta da un minimo di 200 milioni di L. reuteriProdentis vivi. Peso netto per pastiglia, 800 mg. Un consumo eccessivo può avere effetti lassativi a causa del contenuto di edulcoranti nel prodotto.

Oggetto della ricerca:

Al fine di valutarne l'efficacia clinica, le pastiglie contenenti probiotico L. reuteri saranno utilizzate per i pazienti sottoposti a terapia ortodontica fissa come precedentemente descritto nello studio pilota. Verrà condotto uno studio controllato randomizzato utilizzando un disegno parallelo con 21 soggetti nel gruppo di prova e 21 soggetti nel gruppo di controllo. Il calcolo della dimensione del campione è stato eseguito assumendo che il gruppo di controllo non avrà alcun cambiamento nei patogeni orali mentre il gruppo di test avrà una riduzione osservata nello studio pilota. Considerando il test a due code con un livello di significatività di 0,05 e una potenza dell'80% nel rilevare tali differenze tra i due gruppi, sarebbero necessari 21 soggetti in ciascun gruppo.

I soggetti sono studenti volontari o pazienti della Facoltà di Odontoiatria, Università Trisakti, sottoposti a trattamento ortodontico con apparecchio fisso, con i seguenti criteri di inclusione: età compresa tra 18 e 28 anni di entrambi i sessi; sottoposti a trattamento ortodontico con apparecchio fisso da un anno; nessun consumo di probiotici (min. 3 mesi prima); nessun consumo di medicinali come antibiotici (min 3 mesi prima) e punteggio PBI >1. I criteri di esclusione sono soggetti con malattie sistemiche e allergici ai probiotici. I soggetti sono stati reclutati da uno studente laureato che faceva parte del gruppo di ricerca. I candidati soggetti che sono riluttanti o non disposti possono rifiutare direttamente l'invito di reclutamento con tutto il cuore, quindi i volontari che sono stati reclutati hanno accettato con tutto il cuore di diventare soggetti di prova di questa ricerca. I soggetti reclutati verranno quindi assegnati in modo casuale al test.

Il tempo per il prelievo di 3 campioni è stato di circa 15 minuti. Il campionamento sarà effettuato presso la clinica esecutiva della Facoltà di Odontoiatria, Trisakti University Dental Hospital. Ai partecipanti verranno dati dentifricio e spazzolino da denti durante il periodo di studio e i soggetti dovranno lavarsi i denti due volte al giorno. Il consumo di probiotici verrà effettuato 2 settimane dopo il controllo ortodontico. I campioni saranno raccolti due volte: il primo giorno (prima di consumare pastiglie) e il 14° giorno dopo che il soggetto ha consumato pastiglie contenenti il ​​probiotico L. reuteri. I probiotici vengono assunti una volta al giorno per due settimane dopo la colazione e dopo essersi lavati i denti.

Metodi di raccolta del campione Prima della raccolta del campione, è stato prima confermato che ogni soggetto è stato sottoposto a test rapido dell'antigene per il rilevamento di SARS-CoV2 a causa dell'attuale pandemia di Covid-19 (30 settembre 2020), in cui il risultato del test deve essere un risultato negativo per ogni paziente. Il risultato negativo indica che il soggetto non ha precedenti infezioni da SARS-CoV2. Dopo la conferma, il campione prelevato dai soggetti entro un periodo minimo di due settimane dal controllo ortodontico è stato raccolto da un dentista/medico specialista dotato di un set completo di dispositivi di protezione individuale.

Il campione di saliva viene raccolto utilizzando il metodo di drenaggio. Il soggetto viene fatto sedere tranquillamente mentre china il capo e apre la bocca per permettere alla saliva di gocciolare passivamente dal labbro inferiore. La saliva viene raccolta utilizzando provette sterili pre-pesate. I soggetti dovrebbero essere a digiuno / due ore dopo la colazione. I soggetti non devono lavarsi i denti per un minimo di 45 minuti prima della raccolta del campione di saliva. Dopo la raccolta della saliva, si consiglia di conservare i campioni di saliva a -20oC, se l'analisi non viene eseguita immediatamente. Inoltre, è meglio aliquotare e congelare i campioni in più provette per evitare cicli di congelamento-scongelamento che potrebbero degradare la qualità della saliva.

Il campione di placca viene raccolto tamponando tutte le superfici (vestibolare/mesiale/distale/linguale/occlusale) del singolo primo molare permanente utilizzando uno stuzzicadenti sterile. Il campione di placca è stato quindi trasferito in una soluzione salina sterile tamponata con fosfato (PBS). Dopo la raccolta, il campione di placca viene conservato a -20°C fino all'esecuzione di ulteriori analisi.

Il campione di fluido crevicolare gengivale (GCF) viene raccolto utilizzando la tecnica della striscia di carta assorbente. Una striscia di carta assorbente viene posizionata delicatamente in un punto selezionato. La striscia viene rimossa dopo aver avvertito una leggera resistenza, approssimativamente dopo essere stata lasciata per 30 secondi. Più strisce di carta per un soggetto vengono raggruppate in diverse provette per microcentrifuga da 1,5 ml contenenti 100 µl di PBS a 4°C. Le provette sono state successivamente conservate a -20°C e utilizzate per ulteriori analisi.

Parte I: Studio clinico per valutare l'efficacia del probiotico sulla risposta infiammatoria gengivale dei pazienti ortodontici utilizzando il metodo ELISA.

Al fine di valutarne l'efficacia clinica, le pastiglie contenenti probiotico L. reuteri saranno utilizzate per i pazienti sottoposti a terapia ortodontica fissa come precedentemente descritto nello studio pilota. Ai soggetti del gruppo di test verranno concesse due settimane di consumo giornaliero delle pastiglie probiotiche somministrate (2x108 CFU/compressa) dopo la colazione e la spazzolatura dei denti. I campioni saranno raccolti da tutti i soggetti il ​​giorno uno e il giorno quattordici. I campioni di fluido crevicolare gengivale, saliva e placca dentale saranno raccolti dai soggetti reclutati prima dell'assegnazione del gruppo utilizzando la metodologia standard come descritto in precedenza [30]. I campioni raccolti saranno conservati in un box frigorifero e posti nel frigorifero del laboratorio a -80°C. I campioni saranno utilizzati per analizzare i livelli di interleuchina 1-beta, interleuchina 6, interleuchina 8, interleuchina 10, TNF alfa, MMP-9 e RANKL utilizzando il metodo ELISA (BioLegend, San Diego, USA).

Parte II: Studio clinico per valutare l'effetto probiotico sul microbioma orale metagenomico su pazienti ortodontici utilizzando NGS La saliva e il campione di placca saranno raccolti da ciascun gruppo. Gli investigatori eseguiranno la profilazione del microbioma per 40 campioni per ogni corsa di sequenziamento. Il DNA batterico e fungino dei campioni raccolti verrà estratto utilizzando il kit di isolamento del DNA MoBio PowerSoil® o il kit Qiagen QIAamp® DNA Mini. Il metodo di estrazione seguirà il protocollo di fabbricazione del kit. Il DNA estratto sarà sottoposto a controllo di qualità utilizzando Nanodrop. La concentrazione di gDNA sarà misurata utilizzando il fluorometro Qubit. La concentrazione di gDNA consigliata per ciascun campione è di 5 ng/uL. Dopo il controllo di qualità, le regioni V3-V4 del gene 16S e 18S rRNA di ciascun campione saranno amplificate mediante PCR. Durante la preparazione della libreria, gli ampliconi ottenuti verranno convertiti in libreria utilizzando il Nextera XT Index Kit (Illumina, USA) secondo le istruzioni del produttore. Tutte le librerie risultanti saranno valutate utilizzando il fluorometro Qubit e saranno sequenziate utilizzando la piattaforma iSeq 100 (Illumina, USA). Il parametro di sequenziamento sarà di 300 cicli con un picco di controllo PhiX del 5%. I dati di profilazione microbica visualizzati dall'esecuzione della sequenza possono essere visualizzati utilizzando il software Illumina Local Run Manager.