Het effect van de consumptie van probiotische Lactobacillus Reuteri Prodentis op de ontstekingsreactie van de gingivale creviculaire vloeistof en metagenomische profielen van het orale microbioom bij orthodontische patiënten.

Aanleiding en achtergrond van het onderzoek

Esthetiek is een primaire overweging voor patiënten die een orthodontische behandeling zoeken. Afgezien van esthetische aspecten kan een slechte uitlijning van tanden echter ook gezondheidsproblemen veroorzaken die de orale functie aantasten, zoals kauwen, spraak, en psychosociale problemen als gevolg van een verminderde dentofaciale esthetiek. Vandaar dat de proefpersonen die een vaste orthodontische behandeling ondergaan, verschillende mondgezondheidsproblemen kunnen tegenkomen. Het is bekend dat de vaste orthodontische behandeling de patiënt het risico geeft op opeenhoping van zware tandplak, wat het symbiotische ecosysteem van het orale microbioom verandert. Dit leidt tot een dysbiotisch oraal microbioom dat meer pathogene soorten herbergt. Er is aangetoond dat pathogene S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans en C. albicans aanwezig zijn bij orthodontische patiënten die onvoldoende aandacht besteden aan mondhygiëneprocedures.

S. mutans is een facultatieve anaerobe Gram-positieve orale bacterie die een belangrijke rol speelt bij het ontstaan ​​van tandcariës. P. gingivalis en A. actinomycetemcomitans zijn anaërobe gramnegatieve orale bacteriën die geassocieerd zijn met parodontitis. Gegevens van de National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III) suggereren dat 14% orthodontische patiënten in de VS ouder dan 20 jaar matige tot ernstige parodontitis hebben. Bovendien is de aanwezigheid en het pathogene potentieel van C. albicans in de parodontale pocket van deze patiënten aangetoond. C. albicans is een robuust biofilmvormend organisme, met therapeutische complicaties.

L. reuteri is een commensale orale probiotische bacterie, waarvan bekend is dat deze de antibacteriële stof reuterine produceert. De structuur van dit antimicrobiële middel met een breed spectrum is gerelateerd aan hydroxypropionaldehyd, dat werd gevormd tijdens fermentatie met glycerol. Eerdere studies hebben een gunstig effect van reuterine tegen pathogene orale bacteriën aangetoond. Bovendien is het veilig te gebruiken als kauwgom of yoghurt. Bovendien bleek uit eerder onderzoek dat L. reuteri-bevattende kauwgom effectief was bij het verminderen van plaque-ophoping en gingivitis bij patiënten met matige tot ernstige gingivitis. Daarom heeft L. reuteri-bevattende kauwgom aanzienlijk bewijs dat het kan worden gebruikt voor de verbetering van de mondgezondheid.

Voorlopige gegevens: als pilotstudie verzamelden onderzoekers speekselmonsters van acht orthodontische patiënten (gemiddelde leeftijd 21 jaar) vóór en twee weken na dagelijkse probiotische consumptie. Van elke proefpersoon werd een duplicaatmonster verzameld. De resultaten toonden significante verminderingen van S. mutans serotype c, S. mutans serotype d, P. gingivalis en A. actinomycetemcomitans na consumptie van probiotica (p<0,05).

Onderzoekskloof: het vermogen van L. reuteri om de ontstekingsreactie te moduleren, namelijk. Interleukine 1 bèta, Interleukine 6, interleukine 8, interleukine 10, TNF alfa, MMP-9 en RANKL en het effect op het orale metagenomische microbioomprofiel bij patiënten die een orthodontische behandeling ondergaan, is niet eerder onderzocht.

materialen en methodes

Lactobacillus reuteri Prodentis zuigtabletten, samen met de placebo's ter vergelijking, werden verscheept vanuit BioGaia, Stockholm, Zweden. Dubbelblinde nummering voor de zuigtabletten werd gedaan voorafgaand aan verzending voor de onderzoekers om vertekening te voorkomen, dus de enige partij die informatie heeft over het verschil tussen zuigtabletten tussen de behandeling en placebo's is BioGaia. Noch de proefpersonen, noch de onderzoekers hebben de kennis over het verschil in zuigtabletten.

BioGaia Prodentis zuigtabletten is een voedingssupplement voor mondgezondheid dat de gepatenteerde melkzuurbacterie Limosilactobacillus reuteri (voorheen bekend als Lactobacillus reuteri) Prodentis (een stamcombinatie van L. reuteri DSM 17938 en L. reuteriATCC PTA 5289) bevat die de goede micro-organismen helpt een natuurlijk evenwicht in de mond. Dit product is veilig voor dagelijks gebruik en het product kan gebruikt worden tijdens zwangerschap en borstvoeding. Ingrediënten van dit product: vulstof (isomalt), L. reuteri DSM 17938 en L. reuteri ATCC PTA 5289, volledig geharde palmolie, pepermuntsmaakstof, mentholsmaakstof, pepermuntolie en zoetstof (sucralose). Eén zuigtablet bevat minimaal 200 miljoen levende L. reuteriProdentis. Nettogewicht per zuigtablet, 800 mg. Overmatige consumptie kan laxerende effecten hebben vanwege het gehalte aan zoetstoffen in het product.

Onderzoeksonderwerp:

Om de klinische werkzaamheid te evalueren, zullen de probiotische L. reuteri-bevattende zuigtabletten worden gebruikt voor de patiënten die een vaste orthodontische therapie ondergaan, zoals eerder beschreven in de pilootstudie. Er zal een gerandomiseerde, gecontroleerde studie worden uitgevoerd met een parallel ontwerp met 21 proefpersonen in de testgroep en 21 proefpersonen in de controlegroep. De berekening van de steekproefomvang werd uitgevoerd door aan te nemen dat de controlegroep geen verandering in de orale pathogenen zal hebben, terwijl de testgroep een reductie zal hebben waargenomen in de pilootstudie. Gezien de tweezijdige test met een significantieniveau van 0,05 en een vermogen van 80% bij het detecteren van dergelijke verschillen tussen de twee groepen, zouden 21 proefpersonen in elke groep nodig zijn.

Onderwerpen zijn studentvrijwilligers of patiënten van de Faculteit der Tandheelkunde, Trisakti University, die een orthodontische behandeling ondergaan met een vast apparaat, met de volgende inclusiecriteria: leeftijd van 18-28 van beide geslachten; het laatste jaar een orthodontische behandeling met een vast hulpmiddel heeft ondergaan; geen gebruik van probiotica (min. 3 maanden eerder); geen gebruik van medicijnen zoals antibiotica (min 3 maanden eerder) en PBI-score >1. De uitsluitingscriteria zijn onderhevig aan systemische ziekten en allergisch voor probiotica. Onderwerpen werden aangeworven door een student in opleiding die deel uitmaakte van het onderzoeksteam. Proefpersonen die terughoudend of onwillig zijn, kunnen de wervingsuitnodiging direct van harte afwijzen, daarom stemden de vrijwilligers die werden aangeworven er van harte mee in om proefpersonen van dit onderzoek te worden. De geworven proefpersonen worden vervolgens willekeurig aan de test toegewezen.

De tijd voor het verzamelen van 3 monsters was ongeveer 15 minuten. De bemonstering zal worden uitgevoerd in de uitvoerende kliniek van de Faculteit der Tandheelkunde, Trisakti Universitair Tandheelkundig Ziekenhuis. Tijdens de onderzoeksperiode krijgen de deelnemers tandpasta en een tandenborstel en de proefpersonen moeten hun tanden drie keer per dag poetsen. Consumptie van probiotica zal 2 weken na controle orthodontie plaatsvinden. Er worden twee keer monsters genomen: op de eerste dag (vóór consumptie van zuigtabletten) en de 14e dag nadat de proefpersoon zuigtabletten met het probioticum L. reuteri heeft ingenomen. Probiotica worden gedurende twee weken eenmaal daags ingenomen na het ontbijt en het tandenpoetsen.

Methoden voor monsterafname Voorafgaand aan de monsterafname werd eerst bevestigd dat elke proefpersoon een snelle antigeentest voor SARS-CoV2-detectie heeft ondergaan vanwege de huidige Covid-19-pandemie (30 september 2020), waarbij het resultaat van de test een negatief resultaat voor elke patiënt. Een negatief resultaat geeft aan dat de proefpersoon in het verleden geen SARS-CoV2-infectie heeft gehad. Na bevestiging is bij de proefpersonen binnen de periode van minimaal twee weken na orthodontiecontrole monster afgenomen door een tandarts/medisch specialist voorzien van een complete set persoonlijke beschermingsmiddelen.

Speekselmonster wordt verzameld met behulp van de draineringsmethode. De proefpersoon wordt gedwongen stil te zitten terwijl hij het hoofd naar beneden buigt en de mond opent om het speeksel passief van de onderlip te laten druppelen. Speeksel wordt verzameld met behulp van steriele, voorgewogen buisjes. Proefpersonen moeten nuchter zijn / twee uur na het ontbijt. Onderwerpen mogen hun tanden niet poetsen gedurende minimaal 45 minuten voorafgaand aan het verzamelen van speekselmonsters. Na speekselafname is het aanbevolen om de speekselmonsters bij -20oC te bewaren, mocht de analyse niet onmiddellijk worden uitgevoerd. Bovendien is het beter om monsters in meerdere buisjes te verdelen en in te vriezen om vries-dooicycli te vermijden die de kwaliteit van het speeksel zouden kunnen verminderen.

Plaquemonster wordt verzameld door met een steriele tandenstoker alle (buccale/mesiale/distale/linguale/occlusale) oppervlakken van de individuele blijvende eerste molaar schoon te vegen. Het plaquemonster werd vervolgens overgebracht naar een steriele met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS). Na verzameling wordt het plaquemonster bewaard bij -20oC tot verdere analyse.

Gingivale creviculaire vloeistof (GCF) monster wordt verzameld met behulp van absorberende papieren striptechniek. Een absorberende papieren strook wordt voorzichtig op een bepaalde plaats geplaatst. De strip wordt verwijderd nadat er lichte weerstand wordt gevoeld, ongeveer na 30 seconden te hebben gestaan. Meerdere papieren stroken voor één proefpersoon worden samengevoegd in verschillende microcentrifugebuisjes van 1,5 ml die 100 µl PBS bij 4oC bevatten. De buisjes werden vervolgens bewaard bij -20oC en gebruikt voor verdere analyse.

Deel I: Klinische proef ter evaluatie van de werkzaamheid van probiotica op tandvleesontstekingsreactie van orthodontische patiënten met behulp van de ELISA-methode.

Om de klinische werkzaamheid te evalueren, zullen de probiotische, L. reuteri-bevattende zuigtabletten worden gebruikt voor de patiënten die een vaste orthodontische therapie ondergaan, zoals eerder beschreven in de pilootstudie. De proefpersonen in de testgroep krijgen twee weken lang dagelijks de probiotische zuigtabletten toegediend (2x108 CFU/tablet) na het ontbijt en het tandenpoetsen. Op dag één en dag veertien worden monsters genomen van alle proefpersonen. De monsters van tandvlees-creviculaire vloeistof, speeksel en tandplak zullen voorafgaand aan de groepstoewijzing worden verzameld bij de gerekruteerde proefpersonen met behulp van standaardmethodologie zoals eerder beschreven [30]. De verzamelde monsters worden in een koelbox bewaard en in de laboratoriumkoelkast geplaatst bij -80°C. De monsters zullen worden gebruikt om het Interleukine 1-bèta-, Interleukine 6-, interleukine 8-, interleukine 10-, TNF-alfa-, MMP-9- en RANKL-niveau te analyseren met behulp van de ELISA-methode (BioLegend, San Diego, VS).

Deel II: Klinische proef ter evaluatie van het probiotische effect op het metagenomische orale microbioom bij orthodontische patiënten met behulp van NGS Speeksel- en tandplakmonsters zullen van elke groep worden verzameld. Onderzoekers zullen microbioomprofilering uitvoeren voor 40 monsters per sequencing-run. Bacterieel en schimmel-DNA van verzamelde monsters wordt geëxtraheerd met behulp van MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit of Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit. De extractiemethode volgt het fabricageprotocol van de kit. Het geëxtraheerde DNA wordt onderworpen aan een kwaliteitscontrole met behulp van Nanodrop. Concentratie van gDNA zal worden gemeten met behulp van Qubit fluorometer. De aanbevolen gDNA-concentratie van elk monster is 5 ng/uL. Na kwaliteitscontrole zullen V3-V4-regio's van het 16S- en 18S-rRNA-gen van elk monster worden geamplificeerd met behulp van PCR. Tijdens de voorbereiding van de bibliotheek worden verkregen amplicons omgezet in een bibliotheek met behulp van Nextera XT Index Kit (Illumina, VS) volgens de instructies van de fabrikant. Alle resulterende bibliotheken zullen worden geëvalueerd met behulp van Qubit-fluorometer en zullen worden gesequenced met behulp van het iSeq 100-platform (Illumina, VS). De sequentieparameter is 300 cycli met een PhiX-controlepiek van 5%. Gevisualiseerde microbiële profileringsgegevens van de sequentierun kunnen worden bekeken met behulp van de Illumina Local Run Manager-software.