Die Wirkung des Verbrauchs von probiotischem Lactobacillus Reuteri Prodentis auf die Entzündungsreaktion der Zahnfleischtaschenflüssigkeit und metagenomische Profile des oralen Mikrobioms bei kieferorthopädischen Patienten.

Begründung und Hintergrund der Studie

Ästhetik ist ein vorrangiges Kriterium für Patienten, die eine kieferorthopädische Behandlung wünschen. Abgesehen von ästhetischen Aspekten kann die Fehlstellung der Zähne jedoch auch gesundheitliche Probleme verursachen, die die orale Funktion beeinträchtigen, wie z. B. Kauen, Sprechen, und psychosoziale Probleme aufgrund einer beeinträchtigten dentofazialen Ästhetik. Daher können die Personen, die sich einer festsitzenden kieferorthopädischen Behandlung unterziehen, auf verschiedene Probleme im Zusammenhang mit der Mundgesundheit stoßen. Es ist bekannt, dass die festsitzende kieferorthopädische Behandlung das Subjekt dem Risiko einer Ansammlung von schwerem Zahnbelag aussetzt, der das symbiotische Ökosystem des oralen Mikrobioms verändert. Dies führt zu einem dysbiotischen oralen Mikrobiom, das mehr pathogene Arten beherbergt. Es wurde gezeigt, dass pathogene S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans und C. albicans bei kieferorthopädischen Patienten vorhanden sind, die der Mundhygiene nicht genügend Aufmerksamkeit schenken.

S. mutans ist ein fakultativ anaerobes grampositives orales Bakterium, das eine wichtige Rolle bei der Entstehung von Zahnkaries spielt. P. gingivalis und A. actinomycetemcomitans sind anaerobe gramnegative orale Bakterien, die mit Parodontitis assoziiert sind. Daten der National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III) deuten darauf hin, dass 14 % der kieferorthopädischen Patienten in den USA über 20 Jahren an einer mittelschweren bis schweren Parodontitis leiden. Darüber hinaus wurde das Vorhandensein und das pathogene Potenzial von C. albicans in der parodontalen Tasche dieser Patienten gezeigt. C. albicans ist ein robuster Biofilm-bildender Organismus, der therapeutische Komplikationen mit sich bringt.

L. reuteri ist ein kommensales orales probiotisches Bakterium, von dem bekannt ist, dass es eine antibakterielle Verbindung, Reuterin, produziert. Die Struktur dieses Breitband-Antibiotikums ist mit Hydroxypropionaldehyd verwandt, das während der Fermentation mit Glycerin gebildet wird. Frühere Studien haben eine vorteilhafte Wirkung von Reuterin gegen pathogene orale Bakterien gezeigt. Darüber hinaus kann es unbedenklich als Kaugummi oder Joghurt verwendet werden. Darüber hinaus ergab eine frühere Studie, dass L. reuteri-haltiges Gummi bei der Reduzierung von Plaqueansammlung und Gingivitis bei Patienten mit mittelschwerer bis schwerer Gingivitis wirksam war. Daher hat L. reuteri-haltiger Kaugummi erhebliche Hinweise darauf, dass er zur Verbesserung der Mundgesundheit verwendet werden kann.

Vorläufige Daten: Als Pilotstudie sammelten die Forscher Speichelproben von acht kieferorthopädischen Patienten (Durchschnittsalter 21 Jahre) vor und zwei Wochen nach der täglichen Einnahme von Probiotika. Von jedem Probanden wurde eine Duplikatprobe entnommen. Die Ergebnisse zeigten signifikante Reduktionen von S. mutans Serotyp c, S. mutans Serotyp d, P. gingivalis und A. actinomycetemcomitans nach probiotischer Einnahme (p < 0,05).

Forschungslücke: Die Fähigkeit von L. reuteri, die Entzündungsreaktion zu modulieren, d. h. Interleukin 1 beta, Interleukin 6, Interleukin 8, Interleukin 10, TNF alpha, MMP-9 und RANKL und die Wirkung auf das orale metagenomische Mikrobiomprofil bei Patienten, die sich einer kieferorthopädischen Behandlung unterziehen, wurden bisher nicht untersucht.

Materialen und Methoden

Lactobacillus reuteri Prodentis Lutschtabletten wurden zusammen mit Placebos zum Vergleich von BioGaia, Stockholm, Schweden, versandt. Die Lutschtabletten wurden vor dem Versand für die Forscher doppelt verblindet nummeriert, um Verzerrungen zu vermeiden. Daher ist BioGaia die einzige Partei, die Informationen über den Unterschied der Lutschtabletten zwischen der Behandlung und Placebos hat. Weder die Testpersonen noch die Forscher haben das Wissen über den Unterschied zwischen Lutschtabletten.

BioGaia Prodentis Lutschtabletten sind ein Nahrungsergänzungsmittel für die Mundgesundheit, das das patentierte Milchsäurebakterium Limosilactobacillus reuteri (früher bekannt als Lactobacillus reuteri) Prodentis (eine Stammkombination aus L. reuteri DSM 17938 und L. reuteri ATCC PTA 5289) enthält, das den guten Mikroorganismen hilft, a natürliches Gleichgewicht im Mund. Dieses Produkt ist sicher für den täglichen Gebrauch und kann während der Schwangerschaft und Stillzeit verwendet werden. Inhaltsstoffe dieses Produkts: Füllstoff (Isomalt), L. reuteri DSM 17938 und L. reuteri ATCC PTA 5289, vollständig gehärtetes Palmöl, Pfefferminzaroma, Mentholaroma, Pfefferminzöl und Süßungsmittel (Sucralose). Eine Lutschtablette besteht aus mindestens 200 Millionen lebenden L. reuteriProdentis. Nettogewicht pro Raute, 800 mg. Übermäßiger Verzehr kann aufgrund des Gehalts an Süßungsmitteln im Produkt abführend wirken.

Forschungsgegenstand:

Um die klinische Wirksamkeit zu bewerten, werden die probiotischen L. reuteri-haltigen Lutschtabletten bei Patienten angewendet, die sich einer festsitzenden kieferorthopädischen Therapie unterziehen, wie zuvor in der Pilotstudie beschrieben. Es wird eine randomisierte kontrollierte Studie mit parallelem Design mit 21 Probanden in der Testgruppe und 21 Probanden in der Kontrollgruppe durchgeführt. Die Berechnung der Stichprobengröße wurde unter der Annahme durchgeführt, dass die Kontrollgruppe keine Veränderung der oralen Pathogene aufweisen wird, während die Testgruppe eine in der Pilotstudie beobachtete Reduktion aufweisen wird. Betrachtet man den zweiseitigen Test mit einem Signifikanzniveau von 0,05 und einer Trennschärfe von 80 % beim Nachweis solcher Unterschiede zwischen den beiden Gruppen, wären 21 Probanden in jeder Gruppe erforderlich.

Die Probanden sind freiwillige Studenten oder Patienten der Fakultät für Zahnmedizin der Trisakti-Universität, die sich einer kieferorthopädischen Behandlung mit festsitzender Apparatur unterziehen, mit den folgenden Einschlusskriterien: Alter von 18 bis 28 Jahren beiderlei Geschlechts; seit einem Jahr in kieferorthopädischer Behandlung mit festsitzender Apparatur; kein Konsum von Probiotika (mind. 3 Monate vorher); keine Einnahme von Medikamenten wie Antibiotika (mindestens 3 Monate zuvor) und PBI-Score >1. Die Ausschlusskriterien unterliegen systemischen Erkrankungen und Allergien gegen Probiotika. Die Probanden wurden von einem Doktoranden rekrutiert, der Teil des Forschungsteams war. Subjektkandidaten, die zögern oder nicht bereit sind, können die Rekrutierungseinladung direkt und von ganzem Herzen ablehnen, daher haben die Freiwilligen, die rekrutiert wurden, von ganzem Herzen zugestimmt, Testpersonen dieser Forschung zu werden. Die rekrutierten Probanden werden dann nach dem Zufallsprinzip dem Test zugeteilt.

Die Zeit für die Entnahme von 3 Proben betrug etwa 15 Minuten. Die Probenahme wird in der Executive Clinic der Fakultät für Zahnmedizin des Trisakti University Dental Hospital durchgeführt. Die Teilnehmer erhalten während des Studienzeitraums Zahnpasta und Zahnbürste und die Probanden müssen ihre Zähne zweimal täglich putzen. Die Einnahme von Probiotika erfolgt 2 Wochen nach der kieferorthopädischen Kontrolle. Die Proben werden zweimal gesammelt: am ersten Tag (vor dem Verzehr der Lutschtabletten) und am 14. Tag nach dem Verzehr der Lutschtabletten mit dem probiotischen L. reuteri. Probiotika werden zwei Wochen lang einmal täglich nach dem Frühstück und dem Zähneputzen eingenommen.

Methoden der Probenentnahme Vor der Probenentnahme wurde zunächst bestätigt, dass sich jeder Proband aufgrund der aktuellen Covid-19-Pandemie (30 negatives Ergebnis für jeden Patienten. Ein negatives Ergebnis zeigt an, dass das Subjekt keine frühere Infektion mit SARS-CoV2 hatte. Nach der Bestätigung wurden Proben von den Probanden innerhalb von mindestens zwei Wochen nach der kieferorthopädischen Kontrolle von einem Zahnarzt / Facharzt entnommen, der mit einer vollständigen persönlichen Schutzausrüstung ausgestattet war.

Die Speichelprobe wird mit der Drainagemethode gesammelt. Der Proband muss ruhig sitzen, während er den Kopf nach unten beugt und den Mund öffnet, damit der Speichel passiv von der Unterlippe tropfen kann. Der Speichel wird mit einem sterilen, vorgewogenen Röhrchen gesammelt. Die Probanden sollten sich zwei Stunden nach dem Frühstück in einem nüchternen Zustand befinden. Die Probanden sollten ihre Zähne mindestens 45 Minuten vor der Speichelprobenentnahme nicht putzen. Nach der Speichelsammlung wird empfohlen, die Speichelproben bei -20 °C zu lagern, falls die Analyse nicht sofort durchgeführt wird. Außerdem ist es besser, Proben in mehreren Röhrchen zu aliquotieren und einzufrieren, um Gefrier-Auftau-Zyklen zu vermeiden, die die Speichelqualität verschlechtern könnten.

Die Plaqueprobe wird durch Abtupfen aller (bukkaler/mesialer/distaler/lingualer/okklusaler) Oberflächen des einzelnen bleibenden ersten Molaren mit einem sterilen Zahnstocher entnommen. Die Plaqueprobe wurde dann in eine sterile phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) überführt. Nach der Entnahme wird die Plaqueprobe bis zur weiteren Analyse bei -20 °C gelagert.

Die Probe der Gingiva-Crevicular-Flüssigkeit (GCF) wird unter Verwendung einer absorbierenden Papierstreifentechnik gesammelt. Ein absorbierender Papierstreifen wird vorsichtig an mehreren ausgewählten Stellen platziert. Der Streifen wird entfernt, nachdem ein leichter Widerstand zu spüren ist, etwa nachdem er 30 Sekunden lang belassen wurde. Mehrere Papierstreifen für einen Probanden werden in mehreren 1,5-ml-Mikrozentrifugenröhrchen mit 100 &mgr;l PBS bei 4°C gepoolt. Die Röhrchen wurden anschließend bei –20°C gelagert und für weitere Analysen verwendet.

Teil I: Klinische Studie zur Bewertung der Wirksamkeit von Probiotika auf die entzündliche Reaktion des Zahnfleisches bei kieferorthopädischen Patienten unter Verwendung der ELISA-Methode.

Um die klinische Wirksamkeit zu bewerten, werden die probiotischen, L. reuteri-haltigen Lutschtabletten bei Patienten angewendet, die sich einer festsitzenden kieferorthopädischen Therapie unterziehen, wie zuvor in der Pilotstudie beschrieben. Die Probanden in der Testgruppe erhalten zwei Wochen lang eine tägliche Einnahme der verabreichten probiotischen Lutschtabletten (2 × 10 8 KBE/Tablette) nach dem Frühstück und Zähneputzen. Von allen Probanden werden am ersten und am vierzehnten Tag Proben gesammelt. Die Proben von Zahnfleischtaschenflüssigkeit, Speichel und Zahnplaque werden von den rekrutierten Probanden vor der Gruppenzuteilung unter Verwendung von Standardmethoden wie zuvor beschrieben [30] gesammelt. Die entnommenen Proben werden in einer Kühlbox gelagert und bei -80 °C in den Laborkühlschrank gestellt. Die Proben werden zur Analyse des Interleukin-1-beta-, Interleukin-6-, Interleukin-8-, Interleukin-10-, TNF-alpha-, MMP-9- und RANKL-Spiegels unter Verwendung des ELISA-Verfahrens (BioLegend, San Diego, USA) verwendet.

Teil II: Klinische Studie zur Bewertung der probiotischen Wirkung auf das metagenomische orale Mikrobiom bei kieferorthopädischen Patienten unter Verwendung von NGS Speichel- und Plaqueproben werden von jeder Gruppe gesammelt. Die Forscher werden Mikrobiom-Profile für 40 Proben bei jedem Sequenzierungslauf erstellen. Bakterien- und Pilz-DNA aus gesammelten Proben wird mit dem MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit oder dem Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit extrahiert. Die Extraktionsmethode folgt dem Herstellungsprotokoll des Kits. Extrahierte DNA wird einer Qualitätsprüfung mit Nanodrop unterzogen. Die Konzentration von gDNA wird mit einem Qubit-Fluorometer gemessen. Die empfohlene gDNA-Konzentration aus jeder Probe beträgt 5 ng/uL. Nach der Qualitätskontrolle werden die V3-V4-Regionen des 16S- und 18S-rRNA-Gens jeder Probe mittels PCR amplifiziert. Während der Bibliotheksvorbereitung werden die erhaltenen Amplikons mit dem Nextera XT Index Kit (Illumina, US) gemäß den Anweisungen des Herstellers in eine Bibliothek umgewandelt. Alle resultierenden Bibliotheken werden mit dem Qubit-Fluorometer ausgewertet und mit der iSeq 100-Plattform (Illumina, USA) sequenziert. Der Sequenzierungsparameter beträgt 300 Zyklen mit einem PhiX-Kontroll-Spike-In von 5 %. Visualisierte mikrobielle Profildaten aus dem Sequenzlauf können mit der Illumina Local Run Manager-Software angezeigt werden.