Probiotic Lactobacillus Reuteri Prodentis 섭취가 치열교정 환자의 치은열구액 염증반응과 구강내 Microbiome의 Metagenomic Profile에 미치는 영향.

연구의 근거 및 배경

미학은 치열 교정 치료를 원하는 환자의 주요 고려 사항입니다. 그러나 심미적인 측면과는 별개로 치아의 부정교합은 저작, 언어 등의 구강 기능에 영향을 미치는 건강 문제와 치아 안면 미학의 손상으로 인한 심리사회적 문제를 유발할 수 있습니다. 따라서 고정 교정 치료를 받는 피험자는 여러 가지 구강 건강 관련 문제에 직면할 수 있습니다. 고정 교정 치료는 대상체를 구강 마이크로바이옴의 공생 생태계를 변경시키는 무거운 치석 축적의 위험에 처하게 하는 것으로 알려져 있습니다. 이것은 더 많은 병원성 종을 품고 있는 dysbiotic 구강 micrbiome으로 이어집니다. 병원성 S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans 및 C. albicans가 구강 위생 절차에 충분히 주의를 기울이지 않는 교정 환자에게 존재하는 것으로 나타났습니다.

S. mutans는 충치 발생에 중요한 역할을 하는 통성 혐기성 그람 양성 구강 박테리아입니다. P. gingivalis 및 A. actinomycetemcomitans는 치주염과 관련된 혐기성 그람 음성 구강 박테리아입니다. NHANES III(National Health and Nutrition Examination Survey)의 데이터에 따르면 미국에서 20세 이상의 치과 교정 환자 14%가 중등도에서 중증의 치주염을 앓고 있습니다. 더욱이, 이들 환자의 치주 주머니에서 C. albicans의 존재 및 병원성 가능성이 나타났다. C. albicans는 치료 합병증을 나타내는 강력한 생물막 형성 유기체입니다.

L. reuteri는 항균 화합물인 reuterin을 생성하는 것으로 알려진 공생 구강 프로바이오틱 박테리아입니다. 이 광범위한 스펙트럼 항균제의 구조는 글리세롤과 함께 발효하는 동안 형성되는 하이드록시프로피온알데히드와 관련이 있습니다. 이전 연구에서는 병원성 구강 박테리아에 대한 루테린의 유익한 효과를 보여주었습니다. 또한 껌이나 요구르트로 사용해도 안전합니다. 또한, 이전 연구에서는 L. reuteri 함유 껌이 중등도에서 중증의 치은염 환자에서 플라크 축적 및 치은염을 감소시키는 데 효과적이라는 사실을 발견했습니다. 따라서 L. reuteri 함유 츄잉껌이 구강 건강 개선에 사용된다는 상당한 증거가 있다.

예비 데이터: 예비 연구로서 연구자들은 일일 프로바이오틱스 섭취 전후 2주 동안 8명의 교정 환자(평균 연령 21세)로부터 타액 샘플을 수집했습니다. 각 피험자로부터 중복 샘플을 수집했습니다. 결과는 프로바이오틱스 섭취 후 S. mutans 혈청형 c, S. mutans 혈청형 d, P. gingivalis 및 A. actinomycetemcomitans에서 상당한 감소를 보여주었습니다(p<0.05).

연구 격차: 염증 반응을 조절하는 L. reuteri의 능력 즉. 인터루킨 1 베타, 인터루킨 6, 인터루킨 8, 인터루킨 10, TNF 알파, MMP-9 및 RANKL 및 치열 교정 치료를 받는 환자의 구강 metagenomic microbiome 프로필에 미치는 영향은 이전에 조사되지 않았습니다.

재료 및 방법

Lactobacillus reuteri Prodentis 마름모꼴은 비교용 위약과 함께 스웨덴 스톡홀름의 BioGaia에서 배송되었습니다. 편향을 방지하기 위해 연구자들이 선적하기 전에 마름모꼴에 대한 이중 맹검 번호 매기기를 수행했습니다. 따라서 치료와 위약 사이의 마름모꼴 차이에 대한 정보를 가진 유일한 당사자는 BioGaia입니다. 시험 대상자도 연구원도 마름모꼴 차이에 대한 지식이 없습니다.

BioGaia Prodentis 정제는 특허받은 유산균 Limosilactobacillus reuteri(구 Lactobacillus reuteri로 알려짐) Prodentis(L. reuteri DSM 17938 및 L. reuteriATCC PTA 5289의 균주 조합)를 함유하는 구강 건강을 위한 식품 보조제로서 좋은 미생물이 입안의 자연스러운 균형. 이 제품은 매일 사용하기에 안전하며 임신 및 수유 중에도 사용할 수 있습니다. 이 제품의 성분: 증량제(isomalt), L. reuteri DSM 17938 및 L. reuteri ATCC PTA 5289, 완전 경화 팜유, 페퍼민트향, 멘톨향, 페퍼민트 오일 및 감미료(수크랄로스). 하나의 마름모꼴은 최소 2억 개의 살아있는 L. reuteriProdentis로 구성됩니다. 마름모꼴 당 순 중량, 800mg. 과도한 소비는 제품의 감미료 함량으로 인해 완하 효과가 있을 수 있습니다.

연구 주제:

임상적 효능을 평가하기 위해 이전 파일럿 연구에서 설명한 바와 같이 고정 교정 치료를 받는 환자에게 프로바이오틱 L. reuteri 함유 사탕을 사용할 예정입니다. 시험군 21명과 대조군 21명을 대상으로 평행설계를 이용한 무작위대조시험을 실시한다. 샘플 크기 계산은 대조군이 구강 병원균에 변화가 없을 것이라고 가정하고 테스트 그룹이 파일럿 연구에서 관찰된 감소를 가질 것이라고 가정하여 수행되었습니다. 0.05 유의 수준과 80% 검정력으로 두 집단 간의 차이를 탐지하는 양면 검정을 고려하면 각 집단에 21명의 피험자가 필요합니다.

피험자는 Trisakti University 치과 학부의 학생 자원 봉사자 또는 환자로 고정 장치로 교정 치료를 받고 있으며 포함 기준은 다음과 같습니다. 성별 중 18-28세; 지난 1년 동안 고정 장치로 교정 치료를 받고 있는 경우; 프로바이오틱스 섭취 없음(최소. 3개월 전); 항생제(최소 3개월 전)와 같은 약물 섭취 없음 및 PBI 점수 >1. 제외 기준은 전신 질환 및 프로바이오틱스에 알레르기가 있는 대상입니다. 피험자는 연구팀의 일원인 대학원생이 모집했습니다. 꺼리거나 원하지 않는 피험자 후보는 모집 초대를 진심으로 거절할 수 있으므로 모집된 지원자는 본 연구의 테스트 대상이 되기로 진심으로 동의했습니다. 모집된 피험자는 테스트에 무작위로 배정됩니다.

3개의 샘플 수집 시간은 약 15분 동안 수행되었다. 샘플링은 Trisakti University Dental Hospital의 치과 학부의 임원 클리닉에서 수행됩니다. 연구 기간 동안 참가자에게는 치약과 칫솔이 제공되며 피험자는 하루에 두 번 양치질을 해야 합니다. 프로바이오틱스의 섭취는 치열 교정 후 2주 후에 이루어집니다. 샘플은 두 번 수집됩니다: 첫째 날(로젠지 섭취 전)과 피험자가 프로바이오틱 L. reuteri를 함유한 로젠지 섭취 후 14일째. 프로바이오틱스는 아침 식사와 양치질 후 2주 동안 하루에 한 번 섭취합니다.

검체 채취 방법 검체 채취에 앞서 현재 코로나19 대유행(2020년 9월 30일)으로 인해 모든 대상자가 SARS-CoV2 검출을 위한 신속 항원 검사를 받았음을 처음 확인했으며, 검사 결과는 모든 환자에게 부정적인 결과. 음성 결과는 피험자가 SARS-CoV2에 과거에 감염되지 않았음을 나타냅니다. 확인 후 교정 관리 후 최소 2주 이내에 피험자로부터 샘플 표본을 완전한 개인 보호 장비 세트를 갖춘 치과의사/의료 전문가가 수집했습니다.

타액 샘플은 배수 방법을 사용하여 수집됩니다. 피험자는 머리를 숙이고 입을 벌려 조용히 앉아 아랫입술에서 수동적으로 타액이 떨어지도록 합니다. 타액은 멸균되고 미리 무게가 매겨진 튜브를 사용하여 수집됩니다. 피험자는 아침 식사 후 2시간 동안 공복 상태여야 합니다. 대상자는 타액 샘플링 수집 전 최소 45분 동안 양치질을 해서는 안 됩니다. 타액 채취 후 분석을 즉시 수행하지 않는 경우 타액 샘플을 -20oC에 보관하는 것이 좋습니다. 또한 타액 품질을 저하시킬 수 있는 동결-해동 주기를 피하기 위해 샘플을 여러 튜브에 분주하고 동결하는 것이 좋습니다.

멸균 이쑤시개를 사용하여 개별 영구 제1대구치의 모든 표면(협측/근심/원위/설측/교합면)을 닦아 플라크 샘플을 수집합니다. 이어서 플라크 샘플을 멸균 인산염 완충 식염수(PBS)로 옮겼습니다. 수집 후 플라크 샘플은 추가 분석이 수행될 때까지 -20oC에서 보관됩니다.

치은 열구액(GCF) 샘플은 흡수지 스트립 기술을 사용하여 수집됩니다. 흡수성 종이 조각을 선택한 여러 부위에 부드럽게 붙입니다. 스트립은 가벼운 저항이 느껴지면 약 30초 동안 방치한 후 제거합니다. 한 피험자에 대한 여러 개의 종이 스트립을 4oC에서 100µl PBS가 들어 있는 여러 개의 1.5ml 마이크로 원심 분리기 튜브에 모입니다. 이후에 튜브를 -20oC에 보관하고 추가 분석에 사용했습니다.

Part I : ELISA 방법을 이용하여 교정 환자의 잇몸 염증 반응에 대한 프로바이오틱스의 효능을 평가하기 위한 임상 시험.

임상적 효능을 평가하기 위해 이전 파일럿 연구에서 설명한 바와 같이 고정 교정 치료를 받는 환자에게 프로바이오틱 L. reuteri 함유 사탕을 사용할 예정입니다. 테스트 그룹의 피험자는 아침 식사와 양치질 후 프로바이오틱 사탕(2x108 CFU/정제)을 2주 동안 매일 섭취하게 됩니다. 샘플은 1일차와 14일차에 모든 피험자로부터 수집됩니다. 치은 열구액, 타액 및 치석 샘플은 이전에 설명한 대로 표준 방법론을 사용하여 그룹 할당 전에 모집된 피험자로부터 수집됩니다[30]. 수집된 샘플은 쿨러 박스에 보관되며 -80°C에서 실험실 냉장고에 보관됩니다. 샘플은 ELISA 방법(BioLegend, San Diego, USA)을 사용하여 Interleukin 1-beta, Interleukin 6, interleukin 8, interleukin 10, TNF alpha, MMP-9 및 RANKL 수준을 분석하는 데 사용됩니다.

파트 II: 각 그룹에서 NGS 타액 및 플라크 샘플을 사용하여 교정 환자의 metagenomic 구강 미생물군집에 대한 프로바이오틱스 효과를 평가하기 위한 임상 시험. 조사관은 시퀀싱이 실행될 때마다 40개의 샘플에 대해 미생물 군집 프로파일링을 수행합니다. 수집된 샘플의 박테리아 및 진균 DNA는 MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit 또는 Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit를 사용하여 추출됩니다. 추출 방법은 키트의 제조 프로토콜을 따릅니다. 추출된 DNA는 Nanodrop을 사용하여 품질 검사를 받게 됩니다. gDNA의 농도는 Qubit fluorometer를 사용하여 측정됩니다. 각 샘플의 권장 gDNA 농도는 5ng/uL입니다. 품질 관리 후 각 샘플의 16S 및 18S rRNA 유전자의 V3-V4 영역을 PCR을 사용하여 증폭합니다. 라이브러리 준비 중에 생성된 앰플리콘은 제조업체의 지침에 따라 Nextera XT Index Kit(Illumina, US)를 사용하여 라이브러리로 변환됩니다. 모든 결과 라이브러리는 Qubit 형광계를 사용하여 평가하고 iSeq 100 플랫폼(Illumina, US)을 사용하여 시퀀싱합니다. 시퀀싱 매개변수는 PhiX 컨트롤 스파이크인이 5%인 300사이클입니다. 시퀀스 실행의 시각화된 미생물 프로파일링 데이터는 Illumina Local Run Manager 소프트웨어를 사용하여 볼 수 있습니다.