Влияние потребления пробиотика Lactobacillus Reuteri Prodentis на воспалительную реакцию жидкости десневой борозды и метагеномные профили микробиома полости рта у ортодонтических пациентов.

Обоснование и предыстория исследования

Эстетика является основным критерием для пациентов, обращающихся за ортодонтическим лечением. Однако, помимо эстетических аспектов, неправильное расположение зубов может также вызывать проблемы со здоровьем, влияющие на функции полости рта, такие как жевание, речь и психосоциальные проблемы из-за нарушения зубочелюстной эстетики. Следовательно, субъекты, проходящие стационарное ортодонтическое лечение, могут столкнуться с рядом проблем, связанных со здоровьем полости рта. Известно, что фиксированное ортодонтическое лечение подвергает субъекта риску накопления тяжелого зубного налета, который изменяет симбиотическую экосистему микробиома полости рта. Это приводит к дисбиотическому микробиому ротовой полости, в котором содержится больше патогенных видов. Было показано, что патогенные S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans и C. albicans присутствуют у ортодонтических пациентов, которые не уделяют должного внимания процедурам гигиены полости рта.

S. mutans представляет собой факультативно-анаэробные грамположительные бактерии полости рта, играющие важную роль в развитии кариеса зубов. P. gingivalis и A. actinomycetemcomitans представляют собой анаэробные грамотрицательные бактерии полости рта, вызывающие пародонтит. Данные Национального исследования здоровья и питания (NHANES III) показывают, что 14% ортодонтических пациентов в США старше 20 лет имеют пародонтит от умеренной до тяжелой степени. Кроме того, показано наличие и патогенный потенциал C. albicans в пародонтальном кармане этих пациентов. C. albicans представляет собой стойкий биопленкообразующий организм, представляющий терапевтические осложнения.

L. reuteri представляет собой комменсальную пероральную пробиотическую бактерию, которая, как известно, вырабатывает антибактериальное соединение реутерин. Структура этого противомикробного препарата широкого спектра действия связана с гидроксипропионовым альдегидом, который образуется при ферментации с глицерином. Предыдущие исследования показали положительный эффект реутерина против патогенных бактерий полости рта. Кроме того, его можно безопасно использовать в качестве жевательных резинок или йогуртов. Кроме того, предыдущее исследование показало, что жевательная резинка, содержащая L. reuteri, эффективно уменьшает накопление налета и гингивит у пациентов с гингивитом средней и тяжелой степени. Таким образом, жевательная резинка, содержащая L. reuteri, имеет убедительные доказательства того, что ее можно использовать для улучшения здоровья полости рта.

Предварительные данные: в качестве пилотного исследования исследователи собрали образцы слюны восьми ортодонтических пациентов (средний возраст 21 год) до и через две недели после ежедневного употребления пробиотиков. У каждого испытуемого брали дубликат образца. Результаты показали значительное снижение S. mutans серотипа c, S. mutans серотипа d, P. gingivalis и A. actinomycetemcomitans после употребления пробиотиков (p<0,05).

Пробел в исследованиях: способность L. reuteri модулировать воспалительную реакцию, а именно. Интерлейкин-1 бета, интерлейкин-6, интерлейкин-8, интерлейкин-10, TNF-альфа, MMP-9 и RANKL, а также влияние на профиль метагеномного микробиома полости рта у пациентов, проходящих ортодонтическое лечение, ранее не исследовались.

Материалы и методы

Пастилки Lactobacillus reuteri Prodentis, наряду с плацебо для сравнения, были отправлены из BioGaia, Стокгольм, Швеция. Двойная слепая нумерация леденцов была проведена перед отправкой для исследователей, чтобы предотвратить предвзятость, поэтому единственная сторона, которая имеет информацию о различиях леденцов между лечением и плацебо, — это BioGaia. Ни испытуемые, ни исследователи ничего не знают о разнице леденцов.

Леденцы BioGaia Prodentis — это пищевая добавка для здоровья полости рта, содержащая запатентованную молочнокислую бактерию Limosilactobacillus reuteri (ранее известную как Lactobacillus reuteri) Prodentis (комбинация штаммов L. reuteri DSM 17938 и L. reuteri ATCC PTA 5289), которая помогает полезным микроорганизмам сохранять естественный баланс во рту. Этот продукт безопасен для ежедневного использования, его можно использовать во время беременности и кормления грудью. Ингредиенты этого продукта: наполнитель (изомальт), L. reuteri DSM 17938 и L. reuteri ATCC PTA 5289, полностью гидрогенизированное пальмовое масло, ароматизатор мяты перечной, ароматизатор ментола, масло мяты перечной и подсластитель (сукралоза). Одна пастилка состоит как минимум из 200 миллионов живых L. reuteriProdentis. Масса нетто одной пастилки 800 мг. Чрезмерное потребление может иметь слабительный эффект из-за содержания подсластителей в продукте.

Предмет исследования:

Чтобы оценить его клиническую эффективность, леденцы, содержащие пробиотик L. reuteri, будут использоваться для пациентов, проходящих несъемное ортодонтическое лечение, как описано ранее в пилотном исследовании. Будет проведено рандомизированное контролируемое исследование с использованием параллельного дизайна с 21 субъектом в тестовой группе и 21 субъектом в контрольной группе. Расчет размера выборки был выполнен, исходя из предположения, что в контрольной группе не будет изменений в отношении оральных патогенов, в то время как в тестовой группе будет наблюдаться снижение, наблюдаемое в пилотном исследовании. Учитывая двусторонний тест с уровнем значимости 0,05 и мощностью 80% при обнаружении таких различий между двумя группами, потребуется 21 субъект в каждой группе.

Субъектами являются студенты-добровольцы или пациенты стоматологического факультета Университета Трисакти, проходящие ортодонтическое лечение с помощью несъемного аппарата, со следующими критериями включения: возраст 18-28 лет любого пола; прохождение ортодонтического лечения несъемной аппаратурой в течение последнего года; отсутствие потребления пробиотиков (мин. за 3 месяца); отсутствие приема лекарств, таких как антибиотики (минимум за 3 месяца до этого) и оценка PBI> 1. Критериями исключения являются системные заболевания и аллергия на пробиотики. Субъекты были набраны аспирантом, который был частью исследовательской группы. Субъекты-кандидаты, которые сопротивляются или не желают, могут напрямую и искренне отказаться от приглашения на работу, поэтому добровольцы, которые были набраны, искренне согласились стать подопытными этого исследования. Затем набранные субъекты будут случайным образом распределены для прохождения теста.

Время сбора 3-х образцов составило примерно 15 минут. Отбор проб будет проводиться в исполнительной клинике стоматологического факультета Стоматологической больницы Университета Трисакти. Участникам будут выдавать зубную пасту и зубную щетку в течение периода исследования, и испытуемым необходимо чистить зубы два раза в день. Потребление пробиотиков будет осуществляться через 2 недели после ортодонтического контроля. Образцы будут собираться дважды: в первый день (перед употреблением леденцов) и на 14-й день после того, как субъект употребил леденцы, содержащие пробиотик L. reuteri. Пробиотики принимают один раз в день в течение двух недель после завтрака и чистки зубов.

Методы сбора образцов Перед сбором образцов было сначала подтверждено, что каждый субъект прошел экспресс-тест на антиген для обнаружения SARS-CoV2 в связи с текущей пандемией Covid-19 (30 сентября 2020 г.), при которой результат теста должен быть отрицательный результат у каждого пациента. Отрицательный результат указывает на то, что у субъекта в прошлом не было инфекции SARS-CoV2. После подтверждения образец образца от субъектов в течение как минимум двухнедельного периода после ортодонтического контроля был собран стоматологом / врачом-специалистом, оснащенным полным комплектом средств индивидуальной защиты.

Образец слюны собирают методом дренирования. Субъекта заставляют сидеть спокойно, наклонив голову и открыв рот, чтобы позволить слюне пассивно стекать с нижней губы. Слюну собирают с помощью стерильных, предварительно взвешенных пробирок. Субъекты должны находиться натощак / через два часа после завтрака. Субъекты не должны чистить зубы как минимум за 45 минут до взятия проб слюны. После сбора слюны рекомендуется хранить образцы слюны при температуре -20oC, если анализ не будет сделан немедленно. Кроме того, лучше разделить образцы на аликвоты и заморозить в нескольких пробирках, чтобы избежать циклов замораживания-оттаивания, которые могут ухудшить качество слюны.

Образец зубного налета собирают путем взятия мазков со всех (буккальных/мезиальных/дистальных/язычных/окклюзионных) поверхностей каждого постоянного первого моляра стерильной зубочисткой. Затем образец зубного налета переносили в стерильный фосфатно-солевой буфер (PBS). После сбора образец зубного налета хранится при температуре -20°C до проведения дальнейшего анализа.

Образец жидкости десневой борозды (GCF) собирают, используя метод полоски абсорбирующей бумаги. Абсорбирующая бумажная полоска аккуратно помещается на несколько выбранных мест. Полоску удаляют после того, как почувствуется легкое сопротивление, примерно через 30 секунд. Несколько бумажных полосок для одного субъекта помещают в несколько микроцентрифужных пробирок объемом 1,5 мл, содержащих 100 мкл PBS при 4°C. Затем пробирки хранили при температуре -20°C и использовали для дальнейшего анализа.

Часть I: Клинические испытания для оценки эффективности пробиотика в отношении воспалительной реакции десен у ортодонтических пациентов с использованием метода ELISA.

Чтобы оценить его клиническую эффективность, пробиотики, содержащие L. reuteri, будут использоваться для пациентов, проходящих несъемную ортодонтическую терапию, как описано ранее в пилотном исследовании. Субъектам в тестовой группе давали две недели ежедневного приема пробиотических пастилок, вводимых (2x108 КОЕ/таблетка) после завтрака и чистки зубов. Образцы будут взяты у всех субъектов в первый и четырнадцатый день. Образцы жидкости десневой борозды, слюны и зубного налета будут собираться у набранных субъектов перед распределением по группам с использованием стандартной методики, как описано ранее [30]. Собранные образцы будут храниться в холодильнике и помещены в лабораторный холодильник при температуре -80°C. Образцы будут использоваться для анализа уровня интерлейкина 1-бета, интерлейкина 6, интерлейкина 8, интерлейкина 10, TNF-альфа, MMP-9 и RANKL с использованием метода ELISA (BioLegend, Сан-Диего, США).

Часть II: Клинические испытания для оценки влияния пробиотиков на метагеномный микробиом полости рта у ортодонтических пациентов с использованием NGS Образцы слюны и зубного налета будут собраны из каждой группы. Исследователи будут проводить профилирование микробиома для 40 образцов при каждом цикле секвенирования. Бактериальная и грибковая ДНК из собранных образцов будет извлечена с использованием набора для выделения ДНК MoBio PowerSoil® или мини-набора Qiagen QIAamp® DNA. Метод экстракции будет соответствовать протоколу изготовления набора. Извлеченная ДНК будет подвергнута проверке качества с помощью Nanodrop. Концентрация гДНК будет измеряться с помощью флуорометра Qubit. Рекомендуемая концентрация геномной ДНК в каждом образце составляет 5 нг/мкл. После контроля качества области V3-V4 гена 16S и 18S рРНК каждого образца будут амплифицировать с помощью ПЦР. Во время подготовки библиотеки полученные ампликоны будут преобразованы в библиотеку с использованием набора Nextera XT Index Kit (Illumina, США) в соответствии с инструкциями производителя. Все полученные библиотеки будут оцениваться с помощью флуорометра Qubit и секвенироваться с использованием платформы iSeq 100 (Illumina, США). Параметр секвенирования составит 300 циклов с всплеском контроля PhiX 5%. Визуализированные данные микробного профилирования из цикла последовательности можно просмотреть с помощью программного обеспечения Illumina Local Run Manager.