A probiotikus Lactobacillus Reuteri Prodentis fogyasztásának hatása a fogíny-résfolyadék gyulladásos reakciójára és az orális mikrobiom metagenomikus profiljára fogszabályozó betegeknél.

A vizsgálat indoklása és háttere

Az esztétikum elsődleges szempont a fogszabályozó kezelést igénylő betegeknél. Az esztétikai szempontokon kívül azonban a fogak helytelen elhelyezkedése a szájfunkciót érintő egészségügyi problémákat is okozhat, mint például rágás, beszéd, valamint a fog- és arc-esztétika károsodása miatti pszichoszociális problémák. Emiatt a fix fogszabályozáson átesett személyek számos szájhigiéniával kapcsolatos problémával találkozhatnak. A fix fogszabályozási kezelésről ismert, hogy az alanynak ki van téve a súlyos foglepedék felhalmozódásának veszélye, amely megváltoztatja a száj mikrobióma szimbiotikus ökoszisztémáját. Ez diszbiotikus orális mikrobiomhoz vezet, amely több patogén fajt tartalmaz. Kimutatták, hogy a patogén S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans és C. albicans jelen vannak olyan fogszabályzós betegeknél, akik nem fordítanak kellő figyelmet a szájhigiénés eljárásokra.

A S. mutans egy fakultatív anaerob Gram-pozitív szájbaktérium, amely fontos szerepet játszik a fogszuvasodás kialakulásában. A P. gingivalis és az A. actinomycetemcomitans egy anaerob Gram-negatív szájbaktérium, amely parodontitishez kapcsolódik. A National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III) adatai arra utalnak, hogy az Egyesült Államokban a 20 év feletti fogszabályzós betegek 14%-a szenved közepesen súlyos vagy súlyos fogágygyulladásban. Ezenkívül kimutatták a C. albicans jelenlétét és patogén potenciálját ezen betegek parodontális zsebében. A C. albicans robusztus biofilm-képző szervezet, amely terápiás szövődményeket okoz.

A L. reuteri egy kommenzális orális probiotikus baktérium, amelyről ismert, hogy antibakteriális vegyületet, a reuterint termel. Ennek a széles spektrumú antimikrobiális szernek a szerkezete a hidroxi-propionaldehidhez kapcsolódik, amely a glicerinnel történő fermentáció során keletkezett. Korábbi vizsgálatok kimutatták, hogy a reuterin jótékony hatással van a patogén szájbaktériumokra. Ezenkívül biztonságosan használható rágógumiként vagy joghurtként. Ezenkívül egy korábbi tanulmány megállapította, hogy az L. reuteri tartalmú gumi hatékonyan csökkentette a plakk felhalmozódását és a fogínygyulladást közepesen súlyos vagy súlyos ínygyulladásban szenvedő betegeknél. Ezért az L. reuteri tartalmú rágóguminak jelentős bizonyítéka van a száj egészségének javítására.

Előzetes adatok: Pilotvizsgálatként a kutatók nyolc fogszabályzós betegtől (átlagéletkor 21 év) nyálmintákat gyűjtöttek a napi probiotikum fogyasztás előtt és két héttel azt követően. Minden alanyból duplikált mintát vettünk. Az eredmények a S. mutans c szerotípus, a S. mutans d szerotípus, a P. gingivalis és az A. actinomycetemcomitans szignifikáns csökkenést mutatták probiotikus fogyasztás után (p<0,05).

Kutatási hiányosságok: Az L. reuteri azon képessége, hogy modulálja a gyulladásos választ, ti. Az interleukin 1 béta, Interleukin 6, interleukin 8, interleukin 10, TNF alfa, MMP-9 és RANKL, valamint az orális metagenomikus mikrobiom profilra gyakorolt ​​hatását fogszabályozó kezelés alatt álló betegeknél korábban nem vizsgálták.

Anyagok és metódusok

A Lactobacillus reuteri Prodentis pasztillákat összehasonlítás céljából a placebóval együtt a svédországi BioGaia-tól (Stockholm) szállították. A pasztillák kettős-vak számozását a kiszállítás előtt végezték el a kutatók az elfogultság megelőzése érdekében, így az egyetlen fél, aki információval rendelkezik a kezelés és a placebó közötti pasztillák közötti különbségről, a BioGaia. Sem a tesztalanyok, sem a kutatók nem ismerik a cukorkák különbségét.

A BioGaia Prodentis pasztillák szájhigiénés étrend-kiegészítő, amely a szabadalmaztatott Limosilactobacillus reuteri (korábbi nevén Lactobacillus reuteri) Prodentis tejsavbaktériumot (L. reuteri DSM 17938 és L. reuteri ATCC PTA 5289 törzsek kombinációja) tartalmazza, amely segít megőrizni a jó mikroorganizmusokat. természetes egyensúly a szájban. Ez a termék biztonságos a mindennapi használatra, terhesség és szoptatás alatt is használható. A termék összetevői: térfogatnövelő anyag (izomalt), L. reuteri DSM 17938 és L. reuteri ATCC PTA 5289, teljesen hidrogénezett pálmaolaj, borsmenta aroma, mentol aroma, borsmenta olaj és édesítőszer (szukralóz). Egy cukorka legalább 200 millió élő L. reuteriProdentisből áll. Pasztillánkénti nettó tömeg 800 mg. A túlzott fogyasztás a termék édesítőszer-tartalma miatt hashajtó hatású lehet.

Kutatás tárgya:

Klinikai hatékonyságának értékelése érdekében a probiotikus L. reuteri tartalmú pasztillákat alkalmazzák a fix fogszabályozási terápián áteső betegeknél a kísérleti vizsgálatban korábban leírtak szerint. Véletlenszerű, kontrollált vizsgálatot végeznek párhuzamos elrendezést alkalmazva a tesztcsoportban 21 alanyal és a kontrollcsoportban 21 alanyal. A mintanagyság kiszámítását úgy végeztük, hogy feltételeztük, hogy a kontrollcsoportban nem lesz változás az orális kórokozókban, míg a tesztcsoportban a kísérleti vizsgálat során csökkenést figyeltek meg. Figyelembe véve a kétoldalú tesztet 0,05 szignifikancia szinttel és 80%-os erővel a két csoport közötti különbségek kimutatásában, minden csoportban 21 alanyra lenne szükség.

Az alanyok önkéntes hallgatók vagy a Trisakti Egyetem Fogorvostudományi Karának páciensei, akik rögzített készülékkel fogszabályozási kezelésen esnek át, a következő felvételi kritériumokkal: 18-28 éves kor bármelyik nemtől; fix készülékkel fogszabályozó kezelésen esett át az elmúlt egy évben; nem fogyaszt probiotikumot (min. 3 hónappal korábban); nem fogyasztott gyógyszert, például antibiotikumot (legalább 3 hónappal korábban) és PBI Score >1. A kizárási kritériumok szisztémás betegségekre és probiotikumra allergiásokra vonatkoznak. A vizsgálati alanyokat egy olyan végzős hallgató toborozta, aki a kutatócsoport tagja volt. Azok az alanyok, akik vonakodnak vagy nem akarnak, közvetlenül visszautasíthatják a toborzási felkérést, ezért a toborzott önkéntesek teljes szívvel beleegyeztek abba, hogy e kutatás tesztalanyaivá váljanak. A felvett alanyokat ezután véletlenszerűen besorolják a tesztbe.

A 3 minta gyűjtési ideje körülbelül 15 perc volt. A mintavétel a Trisakti Egyetemi Fogorvosi Kórház Fogorvostudományi Karának vezetői klinikáján történik. A résztvevők fogkrémet és fogkefét kapnak a vizsgálati időszak alatt, és az alanyoknak naponta kétszer kell fogat mosniuk. A probiotikumok fogyasztása a fogszabályozási kontroll után 2 héttel történik. A mintavétel kétszer történik: az első napon (a cukorkák fogyasztása előtt) és a 14. napon azután, hogy az alany L. reuteri probiotikumot tartalmazó pasztillákat fogyasztott. A probiotikumokat naponta egyszer kell bevenni két hétig reggeli és fogmosás után.

Mintavételi módszerek A mintavételt megelőzően először megerősítették, hogy a jelenlegi Covid-19 világjárvány miatt (2020. szeptember 30.) minden alany átesett a SARS-CoV2 kimutatására szolgáló gyors antigénteszten, amelyben a teszt eredményének negatív eredmény minden betegnél. A negatív eredmény azt jelzi, hogy az alanynak nem volt korábban SARS-CoV2 fertőzése. A megerősítést követően az alanyoktól a fogszabályozási kontrollt követő minimum két héten belül mintát vett fogorvos/szakorvos, aki teljes egyéni védőfelszereléssel rendelkezik.

A nyálminta gyűjtése drénezési módszerrel történik. Az alany csendesen ül, miközben lehajtja a fejét és kinyitja a száját, hogy a nyál passzívan csöpögjön az alsó ajkáról. A nyálat steril, előre súlyozott csövek segítségével gyűjtik össze. Az alanyoknak éhgyomorra kell lenniük / két órával a reggeli után. Az alanyoknak a nyálmintavétel előtt legalább 45 percig nem szabad fogat mosniuk. A nyálmintákat nyálgyűjtés után -20oC-on javasolt tárolni, ha az elemzést nem azonnal végezzük el. Ezenkívül jobb, ha a mintákat aliquot részekre osztja és több csőben lefagyasztja, hogy elkerülje a fagyasztási-olvadási ciklusokat, amelyek ronthatják a nyál minőségét.

A plakkmintát úgy kell gyűjteni, hogy az egyes permanens első őrlőfog összes (bukkális/mesiális/distalis/linguális/okkluzális) felületét steril fogpiszkáló segítségével lekenjük. A plakkmintát ezután steril foszfáttal pufferelt sóoldatba (PBS) vittük át. A gyűjtés után a plakkmintát -20oC-on tároljuk a további elemzésig.

Gingival crevicular fluid (GCF) mintát gyűjtünk abszorbens papírcsíkos technikával. Egy nedvszívó papírcsíkot óvatosan helyezünk a kiválasztott helyre. A csíkot a fényellenállás érzékelése után távolítják el, körülbelül 30 másodpercig. Egy alanyhoz tartozó több papírcsíkot több 1,5 ml-es mikrocentrifuga csőbe egyesítenek, amelyek 100 µl PBS-t tartalmaznak 4 °C-on. A csöveket ezt követően -20 oC-on tároltuk, és további elemzésekhez használtuk fel.

I. rész: Klinikai vizsgálat a probiotikum hatékonyságának értékelésére fogszabályzós betegek ínygyulladásos válaszreakciójában ELISA módszerrel.

Klinikai hatékonyságának értékelése érdekében a probiotikus, L. reuteri tartalmú pasztillákat alkalmazzák a fix fogszabályozási terápián áteső betegeknél, a kísérleti tanulmányban korábban leírtak szerint. A tesztcsoportba tartozó alanyok napi két hétig kapnak probiotikus pasztillából (2x108 CFU/tabletta) a reggeli és a fogmosás után. Az első és a tizennegyedik napon minden alanytól mintát gyűjtenek. A fogíny-résfolyadék-, nyál- és fogplakk-mintákat a csoportfelosztás előtt gyűjtik a felvett alanyoktól a korábban leírt standard módszertannal [30]. Az összegyűjtött mintákat hűtődobozban tároljuk és -80°C-os laboratóriumi hűtőszekrénybe helyezzük. A mintákat az Interleukin 1-béta, Interleukin 6, interleukin 8, interleukin 10, TNF alfa, MMP-9 és RANKL szint elemzésére használjuk ELISA módszerrel (BioLegend, San Diego, USA).

II. rész: Klinikai vizsgálat a metagenomikus orális mikrobiomra gyakorolt ​​probiotikus hatás értékelésére fogszabályzós betegeken NGS nyál és plakkminta segítségével minden csoportból. A kutatók minden szekvenálási futtatás során 40 mintánál mikrobiomprofilt készítenek. Az összegyűjtött minták bakteriális és gombás DNS-ét a MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit vagy a Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit segítségével extraháljuk. Az extrakciós módszer a kit gyártási protokollját követi. A kivont DNS-t Nanodrop segítségével minőségellenőrzésnek vetik alá. A gDNS koncentrációját Qubit fluorométerrel mérjük. Az ajánlott gDNS-koncentráció minden mintában 5 ng/ul. A minőség-ellenőrzést követően minden minta 16S és 18S rRNS-génjének V3-V4 régióit PCR-rel amplifikáljuk. A könyvtár előkészítése során a kapott amplikonokat a Nextera XT Index Kit (Illumina, US) segítségével könyvtárrá alakítják át a gyártó utasításainak megfelelően. Az összes eredményül kapott könyvtárat Qubit fluorométerrel értékeljük, és az iSeq 100 platformon (Illumina, USA) szekvenáljuk. A szekvenálási paraméter 300 ciklus lesz 5%-os PhiX vezérlési spike-in mellett. A sorozatfutás vizualizált mikrobaprofil-adatai az Illumina Local Run Manager szoftverrel tekinthetők meg.