El efecto del consumo de probióticos Lactobacillus Reuteri Prodentis sobre la respuesta inflamatoria del líquido crevicular gingival y los perfiles metagenómicos del microbioma oral en pacientes de ortodoncia.

Justificación y antecedentes del estudio

La estética es una consideración primordial para los pacientes que buscan tratamiento de ortodoncia. Sin embargo, además de los aspectos estéticos, la mala alineación de los dientes también puede causar problemas de salud que afectan la función oral, como la masticación, el habla y problemas psicosociales debido a una estética dentofacial deteriorada. Por lo tanto, los sujetos que se someten a un tratamiento de ortodoncia fijo pueden encontrarse con varios problemas relacionados con la salud bucal. Se sabe que el tratamiento de ortodoncia fijo pone al sujeto en riesgo de acumulación de placa dental pesada que altera el ecosistema simbiótico del microbioma oral. Esto conduce a un microbioma oral disbiótico que alberga más especies patógenas. Se ha demostrado que S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans y C. albicans patógenos están presentes en pacientes ortodóncicos que no prestan suficiente atención a los procedimientos de higiene bucal.

S. mutans es una bacteria oral Gram-positiva anaerobia facultativa que tiene un papel importante en el desarrollo de la caries dental. P. gingivalis y A. actinomycetemcomitans son bacterias orales anaerobias gramnegativas asociadas con la periodontitis. Los datos de la Encuesta Nacional de Examen de Salud y Nutrición (NHANES III) sugieren que el 14 % de los pacientes de ortodoncia en los EE. UU. mayores de 20 años tienen periodontitis de moderada a grave. Además, se ha demostrado la presencia y el potencial patogénico de C. albicans en la bolsa periodontal de estos pacientes. C. albicans es un organismo robusto formador de biopelículas que presenta una complicación terapéutica.

L. reuteri es una bacteria probiótica oral comensal conocida por producir un compuesto antibacteriano, la reuterina. La estructura de este antimicrobiano de amplio espectro está relacionada con el hidroxipropionaldehído, que se formó durante la fermentación con glicerol. Estudios previos han demostrado el efecto beneficioso de la reuterina contra las bacterias orales patógenas. Además, es seguro usarlo como chicles o yogures. Además, un estudio anterior encontró que la goma de mascar que contenía L. reuteri era eficaz para reducir la acumulación de placa y la gingivitis en pacientes con gingivitis de moderada a grave. Por lo tanto, la goma de mascar que contiene L. reuteri tiene evidencia considerable para ser utilizada para mejorar la salud bucal.

Datos preliminares: como estudio piloto, los investigadores recolectaron muestras de saliva de ocho pacientes de ortodoncia (edad promedio 21 años) antes y dos semanas después del consumo diario de probióticos. Se recogió una muestra por duplicado de cada sujeto. Los resultados mostraron reducciones significativas en S. mutans serotipo c, S. mutans serotipo d, P. gingivalis y A. actinomycetemcomitans después del consumo de probióticos (p<0,05).

Brecha de investigación: la capacidad de L. reuteri para modular la respuesta inflamatoria, a saber. Interleucina 1 beta, interleucina 6, interleucina 8, interleucina 10, TNF alfa, MMP-9 y RANKL y el efecto sobre el perfil del microbioma metagenómico oral en pacientes sometidos a tratamiento de ortodoncia no se ha investigado previamente.

Materiales y métodos

Las pastillas de Lactobacillus reuteri Prodentis, junto con los placebos para comparación, se enviaron desde BioGaia, Estocolmo, Suecia. La numeración doble ciego de las pastillas se realizó antes del envío para que los investigadores evitaran sesgos, por lo que la única parte que tiene información sobre la diferencia de las pastillas entre el tratamiento y los placebos es BioGaia. Ni los sujetos de prueba ni los investigadores tienen conocimiento sobre la diferencia de las pastillas.

Las pastillas BioGaia Prodentis son un complemento alimenticio para la salud bucal que contiene la bacteria del ácido láctico patentada Limosilactobacillus reuteri (anteriormente conocida como Lactobacillus reuteri) Prodentis (una combinación de cepas de L. reuteri DSM 17938 y L. reuteriATCC PTA 5289) que ayuda a los buenos microorganismos a mantener un equilibrio natural en la boca. Este producto es seguro para el uso diario y puede usarse durante el embarazo y la lactancia. Ingredientes de este producto: agente de carga (isomalt), L. reuteri DSM 17938 y L. reuteri ATCC PTA 5289, aceite de palma totalmente hidrogenado, sabor a menta, sabor a mentol, aceite de menta y edulcorante (sucralosa). Una pastilla consta de un mínimo de 200 millones de L. reuteriProdentis vivas. Peso neto por pastilla, 800 mg. El consumo excesivo puede tener efectos laxantes debido al contenido de edulcorantes en el producto.

Tema de investigación:

Con el fin de evaluar su eficacia clínica, las pastillas probióticas que contienen L. reuteri se utilizarán para los pacientes que se someten a una terapia de ortodoncia fija como se describió anteriormente en el estudio piloto. Se realizará un ensayo controlado aleatorio utilizando un diseño paralelo con 21 sujetos en el grupo de prueba y 21 sujetos en el grupo de control. El cálculo del tamaño de la muestra se realizó asumiendo que el grupo de control no experimentará ningún cambio en los patógenos orales, mientras que el grupo de prueba tendrá una reducción observada en el estudio piloto. Considerando la prueba bilateral con un nivel de significación de 0,05 y un poder del 80% para detectar tales diferencias entre los dos grupos, se requerirían 21 sujetos en cada grupo.

Los sujetos son estudiantes voluntarios o pacientes de la Facultad de Odontología de la Universidad de Trisakti, que se someten a un tratamiento de ortodoncia con aparatos fijos, con los siguientes criterios de inclusión: edad de 18 a 28 años de cualquier género; en tratamiento de ortodoncia con aparato fijo durante el último año; sin consumo de probióticos (min. 3 meses antes); sin consumo de medicamento tipo antibiótico (mínimo 3 meses previos) y PBI Score >1. Los criterios de exclusión son sujetos con enfermedades sistémicas y alérgicos al probiótico. Los sujetos fueron reclutados por un estudiante de posgrado en curso que formaba parte del equipo de investigación. Los candidatos sujetos que son reacios o no están dispuestos pueden rechazar directamente la invitación de reclutamiento de todo corazón, por lo tanto, los voluntarios que fueron reclutados aceptaron de todo corazón convertirse en sujetos de prueba de esta investigación. Los sujetos reclutados serán asignados aleatoriamente a la prueba.

El tiempo para la toma de 3 muestras fue de aproximadamente 15 minutos. El muestreo se llevará a cabo en la clínica ejecutiva de la Facultad de Odontología, Hospital Dental de la Universidad de Trisakti. Los participantes recibirán pasta de dientes y cepillo de dientes durante el período de estudio y los sujetos deben cepillarse los dientes dos veces al día. El consumo de probióticos se realizará 2 semanas después del control de ortodoncia. Las muestras se recogerán dos veces: el primer día (antes de consumir las pastillas) y el día 14 después de que el sujeto consumiera las pastillas que contenían el probiótico L. reuteri. Los probióticos se toman una vez al día durante dos semanas después del desayuno y del cepillado de dientes.

Métodos de recolección de muestras Previo a la recolección de muestras, primero se confirmó que a todo sujeto se le haya realizado la prueba rápida de antígeno para la detección de SARS-CoV2 debido a la pandemia actual de Covid-19 (30 de septiembre de 2020), en la que el resultado de la prueba debe ser un resultado negativo para todos los pacientes. El resultado negativo indica que el sujeto no tiene una infección anterior de SARS-CoV2. Después de la confirmación, la muestra de muestra de los sujetos dentro de un período mínimo de dos semanas después del control de ortodoncia, fue recolectada por un dentista/especialista médico equipado con un juego completo de equipo de protección personal.

La muestra de saliva se recoge mediante el método de drenaje. Se hace que el sujeto se siente en silencio mientras inclina la cabeza y abre la boca para permitir que la saliva gotee pasivamente del labio inferior. La saliva se recolecta utilizando tubos estériles previamente pesados. Los sujetos deben estar en ayunas / dos horas después del desayuno. Los sujetos no deben cepillarse los dientes durante un mínimo de 45 minutos antes de la recolección de muestras de saliva. Después de la recolección de saliva, se recomienda almacenar las muestras de saliva a -20oC, en caso de que el análisis no se realice de inmediato. Además, es mejor alicuotar y congelar las muestras en varios tubos para evitar ciclos de congelación y descongelación que podrían degradar la calidad de la saliva.

La muestra de placa se recolecta frotando todas las superficies (bucal/mesial/distal/lingual/oclusal) del primer molar permanente individual con un palillo estéril. A continuación, la muestra de placa se transfirió a una solución salina tamponada con fosfato (PBS) estéril. Después de la recolección, la muestra de placa se almacena a -20oC hasta que se realice un análisis adicional.

La muestra de fluido crevicular gingival (GCF) se recolecta utilizando la técnica de tira de papel absorbente. Una tira de papel absorbente se coloca suavemente en varios sitios seleccionados. La tira se quita después de sentir una ligera resistencia, aproximadamente después de dejarla durante 30 segundos. Se agrupan varias tiras de papel para un sujeto en varios tubos de microcentrífuga de 1,5 ml que contienen 100 µl de PBS a 4oC. Posteriormente, los tubos se almacenaron a -20oC y se usaron para análisis posteriores.

Parte I: Ensayo clínico para evaluar la eficacia de probióticos en la respuesta inflamatoria gingival de pacientes de ortodoncia utilizando el método ELISA.

Con el fin de evaluar su eficacia clínica, las pastillas probióticas que contienen L. reuteri se utilizarán para los pacientes que se someten a una terapia de ortodoncia fija como se describió anteriormente en el estudio piloto. Los sujetos en el grupo de prueba recibirán dos semanas de consumo diario de las pastillas probióticas administradas (2x108 CFU/tableta) después del desayuno y cepillado de dientes. Se recogerán muestras de todos los sujetos el día uno y el día catorce. Las muestras de líquido crevicular gingival, saliva y placa dental se recolectarán de los sujetos reclutados antes de la asignación del grupo utilizando la metodología estándar como se describió anteriormente [30]. Las muestras recolectadas se almacenarán en una caja de refrigeración y se colocarán en el refrigerador del laboratorio a -80°C. Las muestras se utilizarán para analizar el nivel de interleucina 1-beta, interleucina 6, interleucina 8, interleucina 10, TNF alfa, MMP-9 y RANKL mediante el método ELISA (BioLegend, San Diego, EE. UU.).

Parte II: Ensayo clínico para evaluar el efecto probiótico en el microbioma oral metagenómico en pacientes de ortodoncia que utilizan NGS Saliva y se recolectarán muestras de placa de cada grupo. Los investigadores realizarán perfiles de microbioma para 40 muestras en cada ejecución de secuenciación. El ADN bacteriano y fúngico de las muestras recolectadas se extraerá con el kit de aislamiento de ADN MoBio PowerSoil® o el mini kit de ADN Qiagen QIAamp®. El método de extracción seguirá el protocolo de fabricación del kit. El ADN extraído se someterá a un control de calidad con Nanodrop. La concentración de gDNA se medirá utilizando un fluorómetro Qubit. La concentración recomendada de ADNg de cada muestra es de 5 ng/uL. Después del control de calidad, las regiones V3-V4 del gen 16S y 18S rRNA de cada muestra se amplificarán mediante PCR. Durante la preparación de la biblioteca, los amplicones producidos se convertirán en una biblioteca utilizando el kit de índice Nextera XT (Illumina, EE. UU.) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Todas las bibliotecas resultantes se evaluarán con el fluorómetro Qubit y se secuenciarán con la plataforma iSeq 100 (Illumina, EE. UU.). El parámetro de secuenciación será de 300 ciclos con un incremento del 5 % en el control PhiX. Los datos de perfil microbiano visualizados del experimento de secuencia se pueden ver con el software Illumina Local Run Manager.