Wpływ spożycia probiotyku Lactobacillus Reuteri Prodentis na reakcję zapalną płynu dziąsłowego i profile metagenomiczne mikrobiomu jamy ustnej u pacjentów ortodontycznych.

Uzasadnienie i tło badania

Estetyka jest priorytetem dla pacjentów zgłaszających się na leczenie ortodontyczne. Jednak oprócz aspektów estetycznych, nieprawidłowe ustawienie zębów może również powodować problemy zdrowotne wpływające na funkcje jamy ustnej, takie jak żucie, mowa i problemy psychospołeczne z powodu upośledzonej estetyki twarzy. W związku z tym osoby poddawane stałemu leczeniu ortodontycznemu mogą napotkać kilka problemów związanych ze zdrowiem jamy ustnej. Wiadomo, że stałe leczenie ortodontyczne naraża pacjenta na ryzyko gromadzenia się ciężkiej płytki nazębnej, która zmienia symbiotyczny ekosystem mikrobiomu jamy ustnej. Prowadzi to do dysbiotycznego mikrobiomu jamy ustnej, który zawiera więcej patogennych gatunków. Wykazano, że chorobotwórcze S. mutans, P. gingivalis, A. actinomycetemcomitans i C. albicans są obecne u pacjentów ortodontycznych, którzy nie przykładają należytej uwagi do zabiegów higienicznych jamy ustnej.

S. mutans jest fakultatywnie beztlenową Gram-dodatnią bakterią jamy ustnej, która odgrywa ważną rolę w rozwoju próchnicy zębów. P. gingivalis i A. actinomycetemcomitans to beztlenowe Gram-ujemne bakterie jamy ustnej związane z zapaleniem przyzębia. Dane z National Health and Nutrition Examination Survey (NHANES III) sugerują, że 14% pacjentów ortodontycznych w USA w wieku powyżej 20 lat ma umiarkowane lub ciężkie zapalenie przyzębia. Ponadto wykazano obecność i potencjał chorobotwórczy C. albicans w kieszonkach przyzębnych tych pacjentów. C. albicans jest silnym organizmem tworzącym biofilm, który stwarza komplikacje terapeutyczne.

L. reuteri jest komensalną doustną bakterią probiotyczną, o której wiadomo, że wytwarza związek przeciwbakteryjny, reuterynę. Struktura tego środka przeciwbakteryjnego o szerokim spektrum działania jest związana z aldehydem hydroksypropiona, który powstaje podczas fermentacji z gliceryną. Wcześniejsze badania wykazały korzystny wpływ reuteryny na patogenne bakterie jamy ustnej. Ponadto można go bezpiecznie stosować jako gumy do żucia lub jogurty. Co więcej, poprzednie badanie wykazało, że guma zawierająca L. reuteri była skuteczna w zmniejszaniu gromadzenia się płytki nazębnej i zapalenia dziąseł u pacjentów z zapaleniem dziąseł o nasileniu umiarkowanym do ciężkiego. Dlatego guma do żucia zawierająca L. reuteri ma wiele dowodów na to, że można ją wykorzystać do poprawy zdrowia jamy ustnej.

Dane wstępne: W ramach badania pilotażowego badacze pobrali próbki śliny od ośmiu pacjentów ortodontycznych (średnia wieku 21 lat) przed i dwa tygodnie po codziennym spożyciu probiotyku. Od każdego osobnika pobrano podwójną próbkę. Wyniki wykazały znaczące zmniejszenie S. mutans serotypu c, S. mutans serotypu d, P. gingivalis i A. actinomycetemcomitans po spożyciu probiotyku (p<0,05).

Luka badawcza: Zdolność L. reuteri do modulowania odpowiedzi zapalnej, a mianowicie. Interleukina 1 beta, interleukina 6, interleukina 8, interleukina 10, TNF alfa, MMP-9 i RANKL oraz wpływ na profil metagenomiczny mikrobiomu jamy ustnej u pacjentów poddawanych leczeniu ortodontycznemu nie był wcześniej badany.

Materiały i metody

Pastylki Lactobacillus reuteri Prodentis, wraz z placebo dla porównania, zostały wysłane z BioGaia, Sztokholm, Szwecja. Podwójnie zaślepiona numeracja pastylek do ssania została wykonana przed wysyłką dla naukowców, aby zapobiec stronniczości, dlatego jedyną stroną, która ma informacje dotyczące różnic między pastylkami do ssania a placebo, jest BioGaia. Ani badani, ani badacze nie mają wiedzy na temat różnic między pastylkami do ssania.

BioGaia Prodentis pastylki do ssania to suplement diety wspomagający zdrowie jamy ustnej, zawierający opatentowaną bakterię kwasu mlekowego Limosilactobacillus reuteri (wcześniej znaną jako Lactobacillus reuteri) Prodentis (kombinacja szczepów L. reuteri DSM 17938 i L. reuteri ATCC PTA 5289), która pomaga dobrym mikroorganizmom w utrzymaniu naturalna równowaga w ustach. Ten produkt jest bezpieczny do codziennego użytku i może być stosowany w czasie ciąży i karmienia piersią. Składniki tego produktu: substancja wypełniająca (izomalt), L. reuteri DSM 17938 i L. reuteri ATCC PTA 5289, całkowicie uwodorniony olej palmowy, aromat miętowy, aromat mentolowy, olejek miętowy i substancja słodząca (sukraloza). Jedna pastylka zawiera co najmniej 200 milionów żywych L. reuteriProdentis. Masa netto na pastylkę, 800 mg. Spożycie w nadmiernych ilościach może mieć działanie przeczyszczające ze względu na zawartość substancji słodzących w produkcie.

Przedmiot badań:

W celu oceny skuteczności klinicznej pastylki do ssania zawierające probiotyk L. reuteri będą stosowane u pacjentów poddawanych stałemu leczeniu ortodontycznemu, jak opisano wcześniej w badaniu pilotażowym. Przeprowadzona zostanie randomizowana, kontrolowana próba z wykorzystaniem projektu równoległego z udziałem 21 osób w grupie testowej i 21 osób w grupie kontrolnej. Obliczenia wielkości próby przeprowadzono przy założeniu, że grupa kontrolna nie będzie miała żadnych zmian w patogenach jamy ustnej, podczas gdy grupa testowa będzie miała spadek obserwowany w badaniu pilotażowym. Biorąc pod uwagę test dwustronny o poziomie istotności 0,05 i mocy 80% w wykrywaniu takich różnic między dwiema grupami, potrzebnych byłoby 21 osób w każdej grupie.

Badani to studenci-wolontariusze lub pacjenci Wydziału Stomatologii Uniwersytetu Trisakti, poddawani leczeniu ortodontycznemu aparatem stałym, z następującymi kryteriami włączenia: wiek 18-28 lat obojga płci; w trakcie leczenia ortodontycznego aparatem stałym przez ostatni rok; brak spożywania probiotyków (min. 3 miesiące wcześniej); brak przyjmowania leku takiego jak antybiotyk (min. 3 miesiące wcześniej) i wynik PBI >1. Kryteriami wykluczającymi są osoby z chorobami ogólnoustrojowymi i uczulone na probiotyk. Badani byli rekrutowani przez studenta studiów magisterskich, który był częścią zespołu badawczego. Kandydaci badani, którzy są niechętni lub niechętni, mogą bezpośrednio odrzucić zaproszenie do rekrutacji z całego serca, dlatego zwerbowani ochotnicy całym sercem zgodzili się zostać obiektami testowymi tego badania. Zrekrutowani badani zostaną następnie losowo przydzieleni do testu.

Czas pobierania 3 próbek wynosił około 15 minut. Pobieranie próbek zostanie przeprowadzone w klinice wykonawczej Wydziału Stomatologii Uniwersyteckiego Szpitala Stomatologicznego Trisakti. Uczestnicy otrzymają pastę do zębów i szczoteczkę do zębów w okresie badania, a badani muszą myć zęby dwa razy dziennie. Spożycie probiotyków nastąpi 2 tygodnie po kontroli ortodontycznej. Próbki będą pobierane dwukrotnie: pierwszego dnia (przed spożyciem pastylek do ssania) oraz 14 dnia po spożyciu przez badanego pastylek zawierających probiotyk L. reuteri. Probiotyki przyjmuje się raz dziennie przez dwa tygodnie po śniadaniu i umyciu zębów.

Metody pobierania próbek Przed pobraniem próbek w pierwszej kolejności potwierdzono, że każda osoba została poddana szybkiemu testowi antygenowemu na wykrycie SARS-CoV2 w związku z panującą pandemią Covid-19 (30 września 2020 r.), w której wynik testu musi być wynik negatywny dla każdego pacjenta. Wynik ujemny wskazuje, że pacjent nie miał w przeszłości zakażenia SARS-CoV2. Po potwierdzeniu, wyrywki od badanych w okresie minimum 2 tygodni po kontroli ortodontycznej, zostały pobrane przez lekarza dentystę/specjalistę medycznego wyposażonego w komplet środków ochrony indywidualnej.

Próbkę śliny pobiera się metodą drenażową. Badany ma siedzieć cicho, pochylając głowę i otwierając usta, aby umożliwić bierne kapanie śliny z dolnej wargi. Ślina jest pobierana za pomocą sterylnych, wstępnie zważonych probówek. Badani powinni być na czczo / dwie godziny po śniadaniu. Osoby badane nie powinny myć zębów przez co najmniej 45 minut przed pobraniem próbki śliny. Po pobraniu śliny zaleca się przechowywanie próbek śliny w temperaturze -20oC, o ile analiza nie zostanie wykonana od razu. Ponadto lepiej jest podzielić i zamrozić próbki w kilku probówkach, aby uniknąć cykli zamrażania i rozmrażania, które mogłyby pogorszyć jakość śliny.

Próbkę płytki nazębnej pobiera się przez wymaz ze wszystkich (policzkowych/mezjalnych/dystalnych/językowych/zwarciowych) powierzchni poszczególnych stałych pierwszych zębów trzonowych za pomocą sterylnej wykałaczki. Próbkę płytki nazębnej przeniesiono następnie do jałowej soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS). Po pobraniu próbkę łysinki przechowuje się w temperaturze -20oC do czasu przeprowadzenia dalszych analiz.

Próbkę płynu szczelinowego dziąseł (GCF) pobiera się techniką pasków bibuły chłonnej. Chłonny pasek papieru delikatnie umieszcza się w kilku wybranych miejscach. Pasek jest usuwany po wyczuciu lekkiego oporu, w przybliżeniu po pozostawieniu go na 30 sekund. Wiele pasków bibuły dla jednego osobnika łączy się w kilka 1,5 ml probówek do mikrowirówki zawierających 100 µl PBS w temperaturze 4oC. Probówki następnie przechowywano w temperaturze -20oC i stosowano do dalszych analiz.

Część I: Badanie kliniczne oceniające skuteczność probiotyku w odpowiedzi zapalnej dziąseł u pacjentów ortodontycznych metodą ELISA.

W celu oceny skuteczności klinicznej probiotyk zawierający L. reuteri w postaci pastylek do ssania zostanie zastosowany u pacjentów poddawanych stałemu leczeniu ortodontycznemu, jak opisano wcześniej w badaniu pilotażowym. Osoby z grupy testowej będą miały zapewnione dwa tygodnie codziennego spożywania probiotycznych pastylek do ssania (2x108 CFU/tabletka) po śniadaniu i umyciu zębów. Próbki zostaną pobrane od wszystkich osób pierwszego i czternastego dnia. Próbki płynu dziąsłowego, śliny i płytki nazębnej zostaną pobrane od rekrutowanych osób przed przydziałem do grup przy użyciu standardowej metodologii opisanej wcześniej [30]. Pobrane próbki będą przechowywane w pojemniku chłodzącym i umieszczone w lodówce laboratoryjnej w temperaturze -80°C. Próbki zostaną wykorzystane do analizy poziomu interleukiny 1-beta, interleukiny 6, interleukiny 8, interleukiny 10, TNF alfa, MMP-9 i RANKL metodą ELISA (BioLegend, San Diego, USA).

Część II: Próba kliniczna mająca na celu ocenę wpływu probiotyku na metagenomiczny mikrobiom jamy ustnej u pacjentów ortodontycznych przy użyciu próbki śliny NGS i płytki nazębnej zostanie pobrana z każdej grupy. Badacze wykonają profilowanie mikrobiomu dla 40 próbek w każdym cyklu sekwencjonowania. DNA bakterii i grzybów z pobranych próbek zostanie wyekstrahowane przy użyciu zestawu MoBio PowerSoil® DNA Isolation Kit lub Qiagen QIAamp® DNA Mini Kit. Metoda ekstrakcji będzie zgodna z protokołem producenta zestawu. Wyekstrahowane DNA zostanie poddane kontroli jakości za pomocą Nanodrop. Stężenie gDNA będzie mierzone za pomocą fluorometru Qubit. Zalecane stężenie gDNA z każdej próbki wynosi 5 ng/ul. Po kontroli jakości, regiony V3-V4 genu 16S i 18S rRNA każdej próbki zostaną zamplifikowane metodą PCR. Podczas przygotowywania biblioteki otrzymane amplikony zostaną przekształcone w bibliotekę przy użyciu zestawu Nextera XT Index Kit (Illumina, USA) zgodnie z instrukcją producenta. Wszystkie powstałe biblioteki zostaną ocenione przy użyciu fluorometru Qubit i zostaną zsekwencjonowane przy użyciu platformy iSeq 100 (Illumina, USA). Parametr sekwencjonowania wyniesie 300 cykli z 5% wzrostem kontroli PhiX. Zwizualizowane dane profilowania drobnoustrojów z przebiegu sekwencji można przeglądać za pomocą oprogramowania Illumina Local Run Manager.