患者来源的神经胶质瘤干细胞类器官

胶质母细胞瘤 (GM) 患者的中位总生存期约为 15 个月。GM 的标准治疗包括最大程度的手术切除，然后使用替莫唑胺 (TMZ) 进行放疗和化疗 (1)。 无论最初的肿瘤反应如何，肿瘤复发都是不可避免的，之后生存期会降至不到 6 个月。 迄今为止，针对可能驱动大部分原发性肿瘤生长的致癌基因的 GM 定制方法在临床试验中均未取得成功 (2)，从而产生了大量未满足的需求，需要采用新方法来克服对当前治疗方案的内在和获得性耐药性。 本研究的目的是建立源自 GM 的原发性患者来源的类器官培养物，以研究导致原发性和复发性 GM 侵袭性肿瘤生长和治疗耐药性的机制。

1. 胶质母细胞瘤的肿瘤间和肿瘤内异质性。 GM 的肿瘤定制方法受到 GM 细胞微环境和基因组改变的肿瘤间和肿瘤内异质性的阻碍。 已经表明，肿瘤由携带不同基因改变的多个克隆组成 (3-7)。 克隆进化模型假定肿瘤形成是在起源细胞中开始的，随后是多种遗传和表观遗传改变的后续积累，从而导致肿瘤细胞存活和生长优势 (8)。 在肿瘤微环境的选择压力下，早期转化细胞中的不同遗传改变会产生多种克隆 (3-7)。 一个重要的微环境应激源是肿瘤内缺氧，这在 GM 中很常见，并且是与生存率降低相关的负面预后和预测因素 (9,10)。

   新出现的证据表明，具有正常干细胞特征的肿瘤细胞亚群，即所谓的神经胶质瘤干细胞 (GSC)，具有内在和获得性治疗耐药性。 GSC 被赋予了特定的特性，包括高肿瘤启动能力、无限的自我更新潜能和多能分化能力，从而产生多样化的后代 (11)。 GSC 由常见的干细胞标记物标记，包括 CD133+、SOX2、Olig1，并且已被证明存在于血管周围区域以及缺氧区域。 GSC 在缺氧条件下扩大 12 取决于糖酵解 (13,14)。

   结合它们的低增殖、增加的 DNA 修复、高抗氧化活性等，使 GCS 比非 GSC 更能抵抗常规治疗（辐射和替莫唑胺）(15,16) {Jamal，2012 #52}。

   这意味着 GSC 是放化疗后 GM 复发的重要驱动因素。 目前没有有效的治疗方法来消除神经胶质瘤干细胞。 阻断肿瘤中的缺氧信号（抑制 GSC 细胞的自我更新和存活）(12,17) 和阻断 NOTCH 干细胞通路（使 GSC 对辐射敏感（18）和 TMZ（19-21）），似乎很有前途但干扰这些途径的药物尚未通过早期临床试验 (22)。

   目前新诊断的胶质母细胞瘤的护理标准是多模式的，包括手术、放射治疗和 TMZ，一种修饰 DNA 嘌呤碱基（O6-鸟嘌呤；N7-鸟嘌呤和 N3-腺嘌呤）的烷化剂。 在放疗中加入 TMZ 可显着提高 GM 患者的总生存期，但最多只能延长 14.6 个月 (1)。 肿瘤内缺氧已被证明会降低放疗和化疗的疗效 (23)。 缺氧的 GM 细胞在遗传上不稳定，并表现出增加的 MGMT 表达，从而对烷基化 TMZ 化疗具有抗性 (24)。

   在非 GSC 中，MGMT 启动子甲基化是对 TMZ 治疗反应的预测标记 (25,26)。 然而，MGMT 甲基化测定的解释很复杂，因为 GM 中 MGMT 启动子甲基化的程度是异质的，异质性水平被低估，因为仅分析 GM 活检或碎片化的 GM 组织 (27,28)。 重要的是，MGMT 还在正常脑内皮细胞和包括肿瘤浸润细胞在内的免疫细胞中表达 (29)。 因此，根据 GM 活组织检查中正常组织污染的程度，MGMT 甲基化水平也可能不同。

   由于使用目前可用的诊断方法无法客观化 MGMT 表达的肿瘤内异质性，并且应始终防止患者治疗不足，目前大多数诊断为“新发”GM 的患者接受 TMZ；尽管 TMZ 在具有 MGMT 未甲基化神经胶质瘤细胞的 GM 中似乎没有什么好处。

   为新诊断的胶质母细胞瘤设计新的治疗方案非常复杂，因为缺乏预测 MGMT 启动子甲基化状态（或 MGMT 表达水平）的 GM 间和 GM 内异质性的诊断工具。 此外，显着 TMZ 反应和改善临床结果所需的 MGMT 表达水平尚不清楚。 因此，由于大多数 GM 由 MGMT 甲基化和 MGMT 未甲基化肿瘤克隆定义，因此可能需要将 TMZ 与靶向非甲基化神经胶质瘤细胞/神经胶质瘤干细胞和/或微环境的药物结合使用。

2. 胶质母细胞瘤复发 即使肉眼可见完全切除 GM，肿瘤细胞仍保留在切除部位。 已经表明，GM 细胞具有很高的传播能力。 侵入性肿瘤细胞在肿瘤块周围逸出并弥漫性浸润正常脑实质。 深度浸润的肿瘤细胞更有可能逃脱手术，目前尚不清楚浸润是否是更具弹性的细胞群的一种特性，它会引发和驱动肿瘤复发。 即使在手术区域外进行术后化疗和放疗以减少浸润性肿瘤细胞后，几乎所有 GM 都会复发，主要发生在切除腔周围。 如果无法进行总切除；初级放射疗法和化学疗法也能够减少克隆多样性，但因此不足以预防复发。

这意味着对多种疗法具有耐药性的肿瘤细胞在全切除后肿瘤腔周围的脑实质中或在放化疗后残留的肿瘤中持续存在，这些肿瘤细胞负责肿瘤的再增殖，使它们成为克服肿瘤复发的关键目标。 GM 的基因组分析表明，复发性肿瘤中的显性克隆由代表原发肿瘤的克隆以及与原始肿瘤几乎没有相似之处的新克隆组成 (3,30,31,32,33)。因此，基于对原发性肿瘤的分析确定的靶点可能无法提供信息来确定防止复发的最佳分子靶点 (5)。

在一线 GM 治疗（放疗、TMZ）失败后，复发似乎伴随着 GSC 向间充质 (MES) 亚型的表型转变（CD133 缺失；BMI1、SOX2 和 CD44 增加）(34-38)。 此类细胞比原发性肿瘤衍生的 GSC 更具攻击性、侵袭性和血管生成性，主要是原神经 (PN) 亚型（CD133+、CD15+）(39-41)。 MES GSC 还表现出较高的炎性体基因表达，例如 IL6、IL8、IL1B1C 和 CXCL2，强化了与微环境相互作用并在复发和进展中发挥重要作用的观念 (42,43)。 正在开发使用免疫调节剂的转基因特定临床试验。 已经表明，MSH（mutS 同系物）突变与 TMZ 耐药性相关，因为它们既未在治疗前 GM 中也未在放疗后 GM 中发现，但在大约一半接受 TMZ 和放疗治疗的复发性 GM 患者中检测到。 这有力地表明 MSH6 改变与对烷化剂治疗的抗性相关。 因此，最初对 TMZ 有反应的 GM 患者可能会获得 MMR 缺陷型超突变表型 (44-46)。 众所周知，完整的错配修复和碱基切除修复 (BER) 有助于有效的 TMZ 细胞毒性。 单独或与 TMZ 联合使用 PARP 抑制剂对 BER 的药理学抑制已在临床试验中显示出前景。 然而，通过碱基切除修复和同源重组修复的上调来补偿减少的 BER，观察到对 PARP 抑制剂的获得性抗性 (47,48)。

总之，了解治疗诱导剩余肿瘤细胞和 GSC 的遗传和表观遗传改变，以及护理标准对发生复发的微环境/生态位的影响，将指导新疗法的开发。

在这个项目中，我们将使用患者来源的神经胶质瘤干细胞类器官 (49)，模仿从头 GM 及其瘤内异质性。 此外，这些源自患者的类器官 (PDO) 类器官将用于研究获得性替莫唑胺耐药性，因此可用于鉴定新型靶向药物。

MGMT 表达中的肿瘤细胞异质性及其与 TMZ 反应的相关性也将使用这些类器官来解决，使用单细胞蛋白质组学和 IHC 进行 MGMT、GSC 标记和外显子组测序（对于常见的驱动突变）来识别那些在 TMZ 下克隆扩增的群体（ RT) 选择和那些消失的。

我们将使用 PDO 探索的另一个有趣的特征是在获得 TMZ 抗性前后分析循环肿瘤 DNA (ctDNA) 或外泌体（分泌的囊泡，其中含有 RNA、小的非编码 RNA、蛋白质和 DNA）的可能性可能导致药理反应和预测性生物标志物的鉴定。 这种生物标志物“液体活检”可能有助于测量 GM 患者血液或腰椎液中的治疗反应，并能够进行剂量调整（升级或去强化或终止）。

PDO（材料成本）的开发将获得资助（607061 PI M. Vooijs, MAASTRO 和 KWF grant Alpe D'Huzes PI M.Vooijs, MAASTRO。 获得肿瘤组织不会产生额外费用。