患者由来の神経膠腫幹細胞オルガノイド

膠芽腫 (GM) 患者の全生存期間の中央値は約 15 か月です。GM の標準治療には、最大限の外科的切除とそれに続く放射線およびテモゾロミド (TMZ) を使用した化学療法が含まれます (1)。 初期の腫瘍反応に関係なく、腫瘍の再発は避けられず、その後の生存期間は 6 か月未満に低下します。 原発腫瘍の大部分の成長を促進する可能性のある癌遺伝子を標的とする GM に合わせたアプローチは、これまでの臨床試験では成功していません (2)。現在の治療スケジュールに対する内因性および後天性の耐性を克服するための新しいアプローチを正当化する、満たされていない大きなニーズが生まれています。 この研究の目的は、GM から一次患者由来のオルガノイド培養を確立して、一次および再発 GM における攻撃的な腫瘍増殖および治療抵抗性に寄与するメカニズムを研究することです。

1. 膠芽腫における腫瘍間および腫瘍内の不均一性。 GM の腫瘍に合わせたアプローチは、GM 細胞の微小環境とゲノム変化の両方の腫瘍間および腫瘍内の不均一性によって妨げられています。 腫瘍は、異なる遺伝子変異を持つ複数のクローンから構成されていることが示されています (3-7)。 クローン進化モデルは、腫瘍形成が元の細胞で開始され、その後、複数の遺伝的およびエピジェネティックな変化の蓄積が続き、腫瘍細胞の生存と成長の利点につながると仮定しています(8)。 初期の形質転換細胞における多様な遺伝子変化は、腫瘍微小環境の選択圧の下でさまざまなクローンを生じさせます (3-7)。 重要な微小環境ストレッサーは腫瘍内低酸素症であり、これは GM でよく見られ、生存率の低下に関連する負の予後および予測因子です (9,10)。

   新たな証拠は、神経膠腫幹細胞 (GSC) と呼ばれる正常な幹細胞の特徴を持つ腫瘍細胞の亜集団が、内因性および後天性の治療抵抗性に関係していることを示しています。 GSC は、高い腫瘍開始能力、無限の自己再生能力、多能性分化能力などの特定の特性を備えており、多様な子孫を生み出します(11)。 GSC は、CD133+、SOX2、Olig1 などの一般的な幹細胞マーカーによってマークされ、低酸素領域と同様に血管周囲領域に存在することが示されています。 GSC は、解糖に依存する低酸素下で拡大します (13,14)。

   それらの低い増殖、増加した DNA 修復、高い抗酸化活性などと組み合わせることで、GCS は非 GSC よりも従来の治療法 (放射線およびテモゾロミド) に対してより耐性になります (15,16) {Jamal, 2012 #52}。

   これは、GSCが化学放射線療法後のGM再発の重要なドライバーを形成することを意味します。 現在、グリオーマ幹細胞を除去する有効な治療法はありません。 腫瘍における低酸素シグナル伝達の遮断 (GSC 細胞の自己再生と生存の阻害)(12,17) および NOTCH 幹細胞経路の遮断 (GSC を放射線 (18) および TMZ(19-21) に感受性にする) は有望に思えますが、これらの経路を妨害する薬物は、まだ初期段階の臨床試験に合格していません(22)。

   新たに診断された神経膠芽腫の現在の標準治療は多面的であり、手術、放射線療法、TMZ（DNAのプリン塩基（O6-グアニン、N7-グアニンおよびN3-アデニン）を修飾するアルキル化剤）で構成されています。 放射線療法に TMZ を追加すると、GM 患者の全生存期間が大幅に延長されましたが、最大 14.6 か月に過ぎませんでした(1)。 腫瘍内の低酸素症は、RT および化学療法の治療効果を低下させることが示されています(23)。 低酸素 GM 細胞は遺伝的に不安定であり、MGMT 発現の増加を示すため、アルキル化 TMZ 化学療法に対する耐性を示します(24)。

   非 GSC では、MGMT プロモーターのメチル化は TMZ 治療に対する反応の予測マーカーです (25,26)。 しかし、GM生検または断片化されたGM組織のみが分析されているため、GMにおけるMGMTプロモーターメチル化の程度は不均一であり、不均一性のレベルは過小評価されているため、MGMTメチル化アッセイの解釈は複雑です(27,28)。 重要なことに、MGMT は正常な脳内皮細胞や、腫瘍浸潤細胞を含む免疫細胞にも発現しています(29)。 したがって、GM生検における正常組織の汚染の程度に応じて、MGMTメチル化のレベルも異なる場合があります。

   MGMT発現における腫瘍内不均一性は、現在利用可能な診断を使用して客観化することはできず、患者の過小治療は常に防止されるべきであるため、現在、「de novo」GMと診断されたほとんどの患者はTMZを受けます。 MGMTのメチル化されていない神経膠腫細胞を持つGMでは、TMZの利点はほとんどないようです。

   MGMT プロモーターのメチル化状態 (または MGMT 発現レベル) の GM 間および GM 内の不均一性を予測する診断ツールが不足しているため、新たに診断された神経膠芽腫に対する新しい治療プロトコルの設計は非常に複雑です。 さらに、重要な TMZ 反応と臨床転帰の改善に必要な MGMT 発現のレベルは不明です。 したがって、ほとんどのGMはMGMTメチル化腫瘍クローンとMGMT非メチル化腫瘍クローンの両方によって定義されるため、TMZを非メチル化神経膠腫細胞/神経膠腫幹細胞および/または微小環境を標的とする薬物と組み合わせることが必要になる場合があります。

2. 膠芽腫の再発 肉眼的に GM の完全切除が達成できたとしても、腫瘍細胞は切除部位に残ります。 GM細胞は高い播種能力を持っていることが示されています。 浸潤した腫瘍細胞は、腫瘍塊の周囲から逃げ出し、正常な脳実質にびまん性に浸潤します。 深く浸潤した腫瘍細胞は手術を逃れる可能性が高く、浸潤が腫瘍の再発を開始および促進するより回復力のある細胞集団の特性であるかどうかは不明です。 浸潤性腫瘍細胞を減少させるための術後の化学療法および外科領域外での放射線照射の後でも、ほとんどすべての GM が再発し、ほとんどが切除腔の周囲である。 肉眼的全切除ができない場合。一次放射線療法と化学療法もクローンの多様性を減らすことができますが、再発を防ぐには不十分です。

これは、複数の治療法に耐性のある腫瘍細胞が、肉眼的全切除後の腫瘍腔周辺の脳実質、または化学放射線療法後の残りの腫瘍に残存し、腫瘍の再増殖に関与しており、腫瘍再発を克服するための重要な標的になっていることを意味します。 GM のゲノム解析により、再発腫瘍の優勢なクローンは、原発腫瘍を代表するクローンと、元の腫瘍とほとんど似ていない新しいクローンで構成されることが示されています (3,30,31,32,33)。したがって、原発腫瘍の分析に基づいて特定された標的は、再発を防ぐための最良の分子標的を特定するのに有益ではない可能性があります(5)。

第一選択の GM 治療 (放射線、TMZ) の失敗後、再発は GSC の間葉系 (MES) サブタイプへの表現型シフト (CD133 の喪失; BMI1、SOX2、および CD44 の増加) を伴うようです (34-38)。 このような細胞は、主に前神経 (PN) サブタイプ (CD133+、CD15+) である原発腫瘍由来の GSC よりも攻撃的で、浸潤性があり、血管新生性があります (39-41)。 MES GSCはまた、IL6、IL8、IL1B1C、CXCL2などのインフラマソーム遺伝子のより高い発現を示し、微小環境と相互作用し、再発と進行に重要な役割を果たすという概念を強化します(42,43)。 免疫モジュレーターを使用して、GM に特化した臨床試験が開発されています。 MSH（mutS ホモログ）変異は、治療前の GM にも放射線療法後の GM にも見られないため、TMZ 耐性と相関することが示されていますが、TMZ と放射線療法で治療された再発 GM 患者の約半数で検出されました。 これは、MSH6 の変化がアルキル化剤療法に対する耐性と関連していることを強く示しています。 したがって、最初に TMZ に応答する GM 患者は、MMR 欠損ハイパーミューテーター表現型を獲得する可能性があります (44-46)。 無傷のミスマッチ修復と塩基除去修復 (BER) が効果的な TMZ 細胞毒性に寄与することは十分に確立されています。 PARP阻害剤を単独で、またはTMZと組み合わせて使用​​したBERの薬理学的阻害は、臨床試験で有望であることが示されています。 しかし、PARP 阻害剤に対する獲得耐性は、減少した BER を補うための塩基除去修復と相同組換え修復のアップレギュレーションを通じて観察されます (47,48)。

結論として、治療によって誘発された残りの腫瘍細胞と GSC の遺伝的およびエピジェネティックな変化、および再発が発生する微小環境/ニッチに対する標準治療の影響を理解することは、新しい治療法の開発を導くでしょう。

このプロジェクトでは、患者由来の神経膠腫幹細胞オルガノイド(49)を使用し、de novo GM とその腫瘍内不均一性を模倣します。 また、これらの患者由来オルガノイド (PDO) オルガノイドは、後天性テモゾロミド耐性の研究に使用されるため、新規の標的薬剤の同定に使用できます。

MGMT 発現における腫瘍細胞の不均一性と TMZ 応答との関連性も、これらのオルガノイドを使用して対処し、MGMT 用の単一細胞プロテオミクスと IHC、GSC マーカー、およびエクソーム シーケンス (一般的なドライバー変異用) を使用して、TMZ の下でクローン的に拡大する集団を特定します ( RT) 選択と消えるもの。

PDO を使用して検討するもう 1 つの興味深い機能は、循環腫瘍 DNA (ctDNA) またはエキソソーム (RNA、小さな非コード RNA、タンパク質、および DNA を含む分泌された小胞) の上清を分析する可能性です。薬理学的反応と予測バイオマーカーの同定につながる可能性があります。 このようなバイオマーカー「リキッドバイオプシー」は、GM患者の血液または腰椎液の治療反応を測定し、用量変更（エスカレーションまたは減量または終了）を可能にするのに役立つ可能性があります。

PDO (材料費) の開発には資金が提供されます (607061 PI M. Voijs, MAASTRO および KWF 助成金 Alpe D'Huzes PI M.Vooijs, MAASTRO. 腫瘍組織の取得に関連する追加費用はありません。