Pasientavledede gliomstamcelleorganoider

Pasienter med glioblastom (GM) har en median total overlevelse på ca. 15 måneder. Standardbehandling for GM omfatter maksimal kirurgisk reseksjon etterfulgt av stråling og kjemoterapi med temozolomid (TMZ) (1). Uavhengig av initial tumorrespons, er tumorresidiv uunngåelig, hvoretter overlevelsen faller til mindre enn 6 måneder. GM-tilpassede tilnærminger rettet mot onkogener som kan drive veksten av hoveddelen av primære svulster, har vært mislykket så langt i kliniske studier(2), noe som skaper et stort udekket behov som garanterer nye tilnærminger for å overvinne iboende og ervervet motstand mot gjeldende behandlingsplaner. Målet med denne forskningen er å etablere primære pasientavledede organoidkulturer fra GM for å studere mekanismer som bidrar til aggressiv tumorvekst og behandlingsresistens i primær og tilbakevendende GM.

1. Inter- og intratumoral heterogenitet i glioblastom. Tumortilpassede tilnærminger for GM blir hemmet av inter- og intratumoral heterogenitet av både mikromiljø og genomiske endringer i GM-celler. Det har blitt vist at svulster er sammensatt av flere kloner med distinkte genetiske endringer (3-7). Den klonale evolusjonsmodellen antyder at tumordannelse initieres i en celle av opprinnelse og følges av den påfølgende akkumulering av flere genetiske og epigenetiske endringer, noe som fører til tumorcelleoverlevelse og vekstfordel (8). Divergerende genetiske endringer i tidlig transformerte celler gir opphav til en rekke kloner under det selektive trykket fra tumormikromiljøet (3-7). En viktig mikromiljøstressor er intratumoral hypoksi, som er hyppig ved GM og en negativ prognostisk og prediktiv faktor assosiert med redusert overlevelse (9,10).

   Nye bevis impliserer en underpopulasjon av tumorceller med karakteristikker av normale stamceller, såkalte gliomstamceller (GSC) i indre og ervervet behandlingsresistens. GSC er utstyrt med spesifikke egenskaper, inkludert høy tumorinitierende evne, ubegrenset selvfornyelsespotensial og kapasitet for multipotent differensiering, som genererer et mangfoldig avkom(11). GSC er merket av vanlige stamcellemarkører inkludert CD133+, SOX2, Olig1, og har vist seg å ligge i den perivaskulære regionen så vel som i hypoksiske områder. GSC utvides under hypoksi12avhengig av glykolyse (13,14).

   Kombinert med lav spredning, økt DNA-reparasjon, høy antioksidantaktivitet og blant annet gjør GCS mer motstandsdyktig mot konvensjonelle behandlinger (stråling og temozolomid) enn ikke-GSC (15,16) {Jamal, 2012 #52}.

   Dette innebærer at GSC-er utgjør en viktig driver for gjentakelse av GM etter kjemoradiasjon. Det finnes for tiden ingen effektive behandlinger for å eliminere gliomstamceller. Blokkering av hypoksisignalering i svulster (hemmer selvfornyelse og overlevelse av GSC-celler)(12,17) og blokkering av NOTCH-stamcelleveien (gjør GSC-er følsomme for stråling(18) og TMZ(19-21)), ser ut til å lovende, men medisiner som forstyrrer disse veiene har ikke passert utover tidlige kliniske studier ennå(22).

   Gjeldende standard for omsorg for nylig diagnostisert glioblastom er multimodal og består av kirurgi, strålebehandling og TMZ, et alkyleringsmiddel som modifiserer purinbaser av DNA (O6-guanin; N7-guanin og N3-adenin). Tillegg av TMZ til strålebehandling har økt den totale overlevelsen for GM-pasienter betydelig, men bare opptil 14,6 måneder(1). Intratumoral hypoksi har vist seg å redusere den terapeutiske effekten av RT og kjemoterapi(23). Hypoksiske GM-celler er genetisk ustabile og viser økt MGMT-ekspresjon og dermed resistens mot alkylerende TMZ-kjemoterapi(24).

   I ikke-GSC-er er MGMT-promoter-metylering en prediktiv markør for respons på TMZ-behandling (25,26). Tolkningen av MGMT-metyleringsanalysen er imidlertid kompleks, siden omfanget av MGMT-promoter-metylering i GM er heterogen og nivået av heterogenitet er undervurdert, siden bare GM-biopsier eller fragmentert GM-vev blir analysert (27,28). Viktigere er at MGMT også uttrykkes i de normale endotelcellene i hjernen og i immunceller inkludert tumorinfiltrerende celler(29). Avhengig av omfanget av normal vevskontaminering i GM-biopsier kan nivået av MGMT-metylering også variere.

   Siden intratumoral heterogenitet i MGMT-ekspresjon ikke kan objektiveres ved bruk av tilgjengelig diagnostikk og siden underbehandling av pasienter bør forhindres til enhver tid, mottar for tiden de fleste pasienter diagnostisert med 'de novo' GM TMZ; selv om det ser ut til å være liten fordel med TMZ i GM-er med MGMT-umetylerte gliomceller.

   Utforming av nye behandlingsprotokoller for nylig diagnostisert glioblastom er ganske komplisert, siden diagnostiske verktøy, som forutsier inter- og intra-GM-heterogenitet av MGMT-promoter-metyleringsstatus (eller nivå av MGMT-ekspresjon), mangler. I tillegg er nivået av MGMT-uttrykk, nødvendig for signifikant TMZ-respons og forbedring av klinisk resultat, ikke kjent. Siden de fleste GM-er er definert av både MGMT-metylerte og MGMT-umetylerte tumorkloner, kan det være nødvendig å kombinere TMZ med legemidler som retter seg mot ikke-metylerte gliomceller/gliomstamceller og/eller mikromiljø.

2. Gjentakelse av glioblastom Selv om en makroskopisk fullstendig reseksjon av en GM kan oppnås, forblir tumorceller på reseksjonsstedet. Det har vist seg at GM-celler har høy kapasitet for spredning. Invaderende tumorceller slipper ut i periferien av tumormassen og infiltrerer diffust det normale hjerneparenkymet. Dypt infiltrerte tumorceller er mer sannsynlig å unnslippe kirurgi og det som ikke er kjent er om infiltrasjon er en egenskap ved en mer motstandsdyktig cellepopulasjon som initierer og driver tilbake svulst. Selv etter postoperativ kjemoterapi og stråling utenfor operasjonsfeltet for å redusere infiltrative tumorceller, kommer nesten all GM tilbake, for det meste rundt reseksjonshulen. Hvis en brutto total reseksjon ikke kan utføres; primær strålebehandling og kjemoterapi er også i stand til å redusere klonal mangfold, men er dermed utilstrekkelig til å forhindre tilbakefall.

Dette innebærer at tumorceller som er resistente mot flere terapier vedvarer i hjerneparenkymet rundt tumorhulen etter total reseksjon eller i den gjenværende svulsten etter kjemoradiasjon som er ansvarlig for tumorrepopulasjon, noe som gjør dem til et kritisk mål for å overvinne tumorresidiv. Genomisk analyse av GM har vist at dominante kloner i tilbakevendende svulster er sammensatt av kloner som er representative for den primære svulsten, så vel som nye kloner med liten likhet med den opprinnelige svulsten (3,30,31,32,33). Følgelig kan det hende at mål identifisert basert på analysen av primærtumoren ikke er informative for å identifisere de beste molekylære målene for å forhindre tilbakefall(5).

Etter svikt i førstelinjes GM-behandling (stråling, TMZ), ser tilbakefall ut til å være ledsaget av et fenotypisk skifte av GSCer til den mesenkymale (MES) subtypen (tap av CD133; økning av BMI1, SOX2 og CD44)(34-38). Slike celler er mer aggressive, invasive og angiogene enn primærtumoravledede GSCer, for det meste den proneurale (PN) subtypen (CD133+, CD15+)(39-41). MES GSC viser også et høyere uttrykk for inflammasomegenene, slik som IL6, IL8, IL1B1C og CXCL2, noe som forsterker forestillingen om at samspill med mikromiljøet spiller en viktig rolle i tilbakefall og progresjon (42,43). GM-spesifikke kliniske studier utvikles ved bruk av immunmodulatorer. Det er vist at MSH (mutS homologe) mutasjoner korrelerer med TMZ-resistens, da de verken finnes i GM før behandling eller strålebehandling etter behandling GM, men ble påvist hos omtrent halvparten av tilbakevendende GM-pasienter behandlet med TMZ og strålebehandling. Dette indikerer sterkt at MSH6-endringer er assosiert med resistens mot alkyleringsmiddelterapi. Dermed kan GM-pasienter som initialt reagerer på TMZ få MMR-defekt hypermutatorfenotype (44-46). Det er godt etablert at en intakt mismatch-reparasjon og base excision repair (BER) bidrar til effektiv TMZ-cytotoksisitet. Farmakologisk hemming av BER ved bruk av PARP-hemmere enten alene eller i kombinasjon med TMZ har vist lovende i kliniske studier. Ervervet resistens mot PARP-hemmere er imidlertid observert gjennom oppregulering av baseeksisjonsreparasjon og homolog rekombinasjonsreparasjon for å kompensere for redusert BER (47,48).

Avslutningsvis vil forståelsen av terapiinduserte genetiske og epigenetiske endringer av de gjenværende tumorcellene og GSC-ene og også innvirkningen av standardbehandling på mikromiljøet/nisjen, der tilbakefall oppstår, veilede utviklingen av nye behandlinger.

I dette prosjektet vil vi bruke pasientavledede gliomstamcelleorganoider(49), som etterligner de novo GM og dens intratumorale heterogenitet. Også disse pasientavledede organoider (PDO) organoider vil bli brukt til å studere ervervet temozolomidresistens og kan dermed brukes til å identifisere nye målrettede midler.

Tumorcelleheterogenitet i MGMT-ekspresjon og dens relevans for TMZ-respons vil også bli adressert ved bruk av disse organoidene, ved bruk av enkeltcelleproteomikk og IHC for MGMT, GSC-markører og eksomsekvensering (for vanlige drivermutasjoner) for å identifisere de populasjonene som klonalt ekspanderer under TMZ ( RT) utvalg og de som forsvinner.

En annen interessant funksjon vi vil utforske ved bruk av PDO er muligheten til å analysere supernatantene for sirkulerende tumor-DNA (ctDNA) eller eksosomer (utskilte vesikler som inneholder RNA, lite ikke-kodende RNA, proteiner samt DNA) før under etter ervervet TMZ-resistens som kan føre til identifisering av farmakologisk respons og prediktive biomarkører. Slike biomarkører "flytende biopsi" kan bli nyttige for å måle behandlingsrespons i blod eller lumbalvæske hos GM-pasienter og muliggjøre dosemodifisering (eskalering eller deintensifisering eller avslutning).

Utviklingen av PUDene (materialekostnader) vil bli finansiert (607061 PI M. Vooijs, MAASTRO og KWF gir Alpe D'Huzes PI M.Vooijs, MAASTRO. Det er ingen ekstra kostnader forbundet med å skaffe svulstvevet.