Patientafledte gliomstamcelleorganoider

Patienter med glioblastom (GM) har en median samlet overlevelse på ca. 15 måneder. Standardbehandling for GM omfatter maksimal kirurgisk resektion efterfulgt af stråling og kemoterapi med temozolomid (TMZ) (1). Uanset initial tumorrespons er tumorgentagelse uundgåelig, hvorefter overlevelsen falder til mindre end 6 måneder. GM-skræddersyede tilgange rettet mod onkogener, der kan drive væksten af ​​hovedparten af ​​primære tumorer, har hidtil været mislykkede i kliniske forsøg(2), hvilket skaber et stort udækket behov, der berettiger nye tilgange til at overvinde iboende og erhvervet resistens over for nuværende behandlingsplaner. Formålet med denne forskning er at etablere primære patientafledte organoide kulturer fra GM for at studere mekanismer, der bidrager til aggressiv tumorvækst og behandlingsresistens i primær og recidiverende GM.

1. Inter- og intratumoral heterogenitet i glioblastom. Tumorskræddersyede tilgange til GM bliver hæmmet af inter- og intratumoral heterogenitet af både mikromiljø og genomiske ændringer i GM-celler. Det er blevet vist, at tumorer er sammensat af multiple kloner, der rummer forskellige genetiske ændringer (3-7). Den klonale udviklingsmodel antager, at tumordannelse initieres i en celle af oprindelse og følges af den efterfølgende akkumulering af flere genetiske og epigenetiske ændringer, hvilket fører til tumorcelleoverlevelse og vækstfordel (8). Divergerende genetiske ændringer i tidligt transformerede celler giver anledning til en række forskellige kloner under det selektive tryk fra tumormikromiljøet (3-7). En vigtig mikromiljøstressfaktor er intratumoral hypoxi, som er hyppig ved GM og en negativ prognostisk og prædiktiv faktor forbundet med reduceret overlevelse (9,10).

   Nye beviser implicerer en subpopulation af tumorceller med karakteristika af normale stamceller, såkaldte gliomstamceller (GSC) i iboende og erhvervet behandlingsresistens. GSC er udstyret med specifikke egenskaber, herunder høj tumorinitierende evne, ubegrænset selvfornyelsespotentiale og kapacitet til multipotent differentiering, hvilket genererer et mangfoldigt afkom(11). GSC er markeret af almindelige stamcellemarkører, herunder CD133+, SOX2, Olig1, og har vist sig at ligge i den perivaskulære region såvel som i hypoxiske områder. GSC udvides under hypoxi12afhængig af glykolyse (13,14).

   Kombineret med deres lave spredning, øgede DNA-reparation, høje antioxidantaktivitet og blandt andet gør GCS mere modstandsdygtig over for konventionelle behandlinger (stråling og temozolomid) end ikke-GSC (15,16) {Jamal, 2012 #52}.

   Dette indebærer, at GSC'er udgør en vigtig drivkraft for gentagelse af GM efter kemoradiation. Der er i øjeblikket ingen effektive behandlinger til at eliminere gliomstamceller. Blokering af hypoxisignalering i tumorer (hæmmer selvfornyelse og overlevelse af GSC-celler)(12,17) og blokering af NOTCH-stamcellevejen (gør GSC'er følsomme over for stråling(18) og TMZ(19-21)), ser ud til at lovende, men lægemidler, der interfererer med disse veje, er endnu ikke gået længere end kliniske forsøg i den tidlige fase(22).

   Den nuværende standard for pleje af nyligt diagnosticeret glioblastom er multimodal og består af kirurgi, strålebehandling og TMZ, et alkyleringsmiddel, der modificerer purinbaser af DNA (O6-guanin; N7-guanin og N3-adenin). Tilføjelsen af ​​TMZ til strålebehandling har øget den samlede overlevelse for GM-patienter betydeligt, men kun op til 14,6 måneder(1). Intratumoral hypoxi har vist sig at nedsætte den terapeutiske effekt af RT og kemoterapi(23). Hypoksiske GM-celler er genetisk ustabile og viser øget MGMT-ekspression og dermed resistens over for alkylerende TMZ-kemoterapi(24).

   I ikke-GSC'er er MGMT-promotormethylering en prædiktiv markør for respons på TMZ-behandling (25,26). Men fortolkningen af ​​MGMT-methyleringsassayet er kompleks, da omfanget af MGMT-promotormethylering i GM er heterogent, og niveauet af heterogenitet er undervurderet, da kun GM-biopsier eller fragmenteret GM-væv analyseres (27,28). Det er vigtigt, at MGMT også udtrykkes i de normale endotelceller i hjernen og i immunceller, herunder tumorinfiltrerende celler(29). Afhængigt af omfanget af normal vævskontamination i GM-biopsier kan niveauet af MGMT-methylering således også variere.

   Da intratumoral heterogenitet i MGMT-ekspression ikke kan objektiveres ved hjælp af aktuelt tilgængelig diagnostik, og da underbehandling af patienter til enhver tid bør forhindres, modtager de fleste patienter diagnosticeret med 'de novo' GM på nuværende tidspunkt TMZ; selvom der synes at være ringe fordel ved TMZ i GM'er med MGMT umethylerede gliomceller.

   Udformning af nye behandlingsprotokoller for nyligt diagnosticeret glioblastom er ret kompleks, da diagnostiske værktøjer, der forudsiger inter- og intra-GM-heterogenitet af MGMT-promotor-methyleringsstatus (eller niveau af MGMT-ekspression), mangler. Derudover kendes niveauet af MGMT-ekspression, der er nødvendigt for signifikant TMZ-respons og forbedring af det kliniske resultat, ikke. Da de fleste GM'er er defineret af både MGMT-methylerede og MGMT-umethylerede tumorkloner, kan det være nødvendigt at kombinere TMZ med lægemidler, der målretter mod ikke-methylerede gliomceller/gliomstamceller og/eller mikromiljø.

2. Gentagelse af glioblastom Selv hvis en makroskopisk fuldstændig resektion af en GM kan opnås, forbliver tumorceller på resektionsstedet. Det har vist sig, at GM-celler har en høj spredningskapacitet. Invaderende tumorceller undslipper ved periferien af ​​tumormassen og infiltrerer diffust det normale hjerneparenkym. Dybt infiltrerede tumorceller er mere tilbøjelige til at undslippe kirurgi, og hvad der ikke vides er, om infiltration er en egenskab ved en mere modstandsdygtig cellepopulation, der initierer og driver tumorgentagelse. Selv efter postoperativ kemoterapi og stråling uden for operationsområdet for at reducere infiltrative tumorceller, kommer næsten al GM tilbage, for det meste omkring resektionskaviteten. Hvis en total resektion ikke kan udføres; primær strålebehandling og kemoterapi er også i stand til at reducere klonal diversitet, men er dermed utilstrækkelige til at forhindre tilbagefald.

Dette indebærer, at tumorceller, der er resistente over for flere terapier, forbliver i hjerneparenkymet omkring tumorhulen efter total resektion eller i den resterende tumor efter kemoradiation, som er ansvarlige for tumorgenpopulation, hvilket gør dem til et kritisk mål for at overvinde tumorgentagelse. Genomisk analyse af GM har vist, at dominerende kloner i tilbagevendende tumorer er sammensat af kloner, der er repræsentative for den primære tumor såvel som nye kloner med ringe lighed med den oprindelige tumor (3,30,31,32,33). Som følge heraf er mål identificeret baseret på analysen af ​​den primære tumor muligvis ikke informative til at identificere de bedste molekylære mål til at forhindre gentagelse(5).

Efter svigt af førstelinjes GM-behandling (stråling, TMZ), ser tilbagefald ud til at være ledsaget af et fænotypisk skift af GSC'er til den mesenkymale (MES) subtype (tab af CD133; forstærkning af BMI1, SOX2 og CD44)(34-38). Sådanne celler er mere aggressive, invasive og angiogene end primære tumorafledte GSC'er, for det meste den proneurale (PN) subtype (CD133+, CD15+)(39-41). MES GSC viser også en højere ekspression af inflammasomgener, såsom IL6, IL8, IL1B1C og CXCL2, hvilket forstærker forestillingen om, at samspil med mikromiljøet og spiller en vigtig rolle i tilbagefald og progression(42,43). GM-specifikke kliniske forsøg er ved at blive udviklet ved hjælp af immunmodulatorer. Det er blevet vist, at MSH (mutS homologe) mutationer korrelerer med TMZ resistens, da de hverken findes i GM før behandling eller strålebehandling efter behandling GM, men blev påvist hos cirka halvdelen af ​​tilbagevendende GM patienter behandlet med TMZ og strålebehandling. Dette indikerer kraftigt, at MSH6-ændringer er forbundet med resistens mod alkyleringsmiddelterapi. Således kan GM-patienter, der initialt reagerer på TMZ, erhverve MMR-defekt hypermutator-fænotype(44-46). Det er veletableret, at en intakt mismatch reparation og base excision reparation (BER) bidrager til effektiv TMZ cytotoksicitet. Farmakologisk hæmning af BER ved brug af PARP-hæmmere enten alene eller i kombination med TMZ har vist lovende i kliniske forsøg. Imidlertid observeres erhvervet resistens over for PARP-hæmmere gennem opregulering af baseudskæringsreparation og homolog rekombinationsreparation for at kompensere for formindsket BER (47,48).

Som konklusion vil forståelsen af ​​de terapiinducerede genetiske og epigenetiske ændringer af de resterende tumorceller og GSC'er og også indvirkningen af ​​standardbehandling på mikromiljøet/nichen, hvor tilbagefald forekommer, guide udviklingen af ​​nye behandlinger.

I dette projekt vil vi bruge patientafledte gliomstamcelleorganoider(49), der efterligner de novo GM og dets intratumorale heterogenitet. Også disse patient-derived organoids (PDO) organoids vil blive brugt til at studere erhvervet temozolomidresistens og kan således bruges til at identificere nye målrettede midler.

Tumorcelle-heterogenitet i MGMT-ekspression og dets relevans for TMZ-respons vil også blive behandlet ved hjælp af disse organoider, ved hjælp af enkeltcelleproteomik og IHC til MGMT, GSC-markører og exome-sekventering (for almindelige drivermutationer) for at identificere de populationer, der klonalt udvider sig under TMZ ( RT) udvælgelse og dem, der forsvinder.

Et andet interessant træk, vi vil undersøge ved brug af PDO, er muligheden for at analysere supernatanterne for cirkulerende tumor-DNA (ctDNA) eller exosomer (udskilte vesikler, som indeholder RNA, små ikke-kodende RNA, proteiner samt DNA) før under efter erhvervet TMZ-resistens, som kan føre til identifikation af farmakologisk respons og prædiktive biomarkører. Sådanne biomarkører 'flydende biopsi' kan blive nyttige til at måle behandlingsrespons i blod eller lændevæske hos GM-patienter og muliggøre dosisændring (eskalering eller intensivering eller afslutning).

Udviklingen af ​​BOB'er (materialeomkostninger) vil blive finansieret (607061 PI M. Vooijs, MAASTRO og KWF giver Alpe D'Huzes PI M.Vooijs, MAASTRO. Der er ingen ekstra omkostninger forbundet med at skaffe tumorvævet.