환자 유래 신경아교종 줄기세포 오가노이드

교모세포종(GM) 환자의 전체 생존 기간 중앙값은 약 15개월입니다. GM에 대한 표준 요법에는 최대 외과적 절제 후 방사선 및 테모졸로마이드(TMZ)를 사용한 화학 요법이 포함됩니다(1). 초기 종양 반응과 상관없이 종양의 재발은 불가피하며 그 이후에는 생존율이 6개월 미만으로 떨어집니다. 대부분의 원발성 종양의 성장을 촉진할 수 있는 종양유전자를 표적으로 하는 GM 맞춤형 접근법은 임상 시험에서 지금까지 성공하지 못했으며(2), 현재 치료 일정에 대한 내재적 및 후천적 내성을 극복하기 위한 새로운 접근법을 보장하는 대규모 미충족 수요를 창출했습니다. 이 연구의 목적은 1차 및 재발 GM에서 공격적인 종양 성장 및 치료 저항성에 기여하는 메커니즘을 연구하기 위해 GM에서 1차 환자 유래 오가노이드 배양을 확립하는 것입니다.

1. 교모세포종에서의 종양간 및 종양내 이질성. GM에 대한 종양 맞춤형 접근법은 GM 세포의 미세 환경 및 게놈 변경 모두의 종양 간 및 종양 내 이질성으로 인해 방해를 받고 있습니다. 종양은 별개의 유전적 변이를 지닌 다수의 클론으로 구성되어 있음이 밝혀졌습니다(3-7). 클론 진화 모델은 종양 형성이 기원 세포에서 시작되고 이후에 여러 유전적 및 후성 유전적 변화가 축적되어 종양 세포 생존 및 성장 이점으로 이어진다고 가정합니다(8). 초기 형질전환된 세포에서 발생하는 유전적 변형은 종양 미세환경의 선택적 압력 하에서 다양한 클론을 생성합니다(3-7). 중요한 미세 환경 스트레스 요인은 종양 내 저산소증이며 이는 GM에서 빈번하며 생존율 감소와 관련된 부정적인 예후 및 예측 인자입니다(9,10).

   새로운 증거는 내인성 및 후천적 치료 저항성에서 소위 신경아교종 줄기 세포(GSC)라고 하는 정상적인 줄기 세포의 특성을 가진 종양 세포의 하위 집단을 의미합니다. GSC는 높은 종양 개시 능력, 무제한 자가 재생 잠재력 및 다능성 분화 능력을 포함하는 특정 특성을 부여받아 다양한 자손을 생성합니다(11). GSC는 CD133+, SOX2, Olig1을 포함한 일반적인 줄기 세포 마커로 표시되며 저산소 영역뿐만 아니라 혈관주위 영역에 존재하는 것으로 나타났습니다. GSC는 해당작용에 의존하는 저산소 상태에서 확장됩니다(13,14).

   낮은 증식, 증가된 DNA 복구, 높은 항산화 활성 등과 결합하여 GCS는 비GSC(15,16) {Jamal, 2012 #52}에 비해 기존 치료(방사선 및 테모졸로마이드)에 대한 내성이 더 커집니다.

   이는 GSC가 화학방사선 요법 후 GM 재발의 중요한 동인을 형성함을 의미합니다. 현재 신경아교종 줄기세포를 제거하는 효과적인 치료법은 없습니다. 종양의 저산소증 신호 차단(GSC 세포의 자가 재생 및 생존 억제)(12,17) 및 NOTCH 줄기 세포 경로 차단(GSC가 방사선에 민감하게 만드는(18) 및 TMZ(19-21)), 유망해 보이지만 이러한 경로를 방해하는 약물은 아직 초기 단계 임상 시험을 통과하지 못했습니다(22).

   새로 진단된 교모세포종의 현재 치료 표준은 복합적이며 수술, 방사선 요법 및 DNA의 퓨린 염기(O6-구아닌, N7-구아닌 및 N3-아데닌)를 변형하는 알킬화제인 TMZ로 구성됩니다. 방사선 요법에 TMZ를 추가하면 GM 환자의 전체 생존 기간이 크게 증가하지만 최대 14.6개월에 불과합니다(1). 종양 내 저산소증은 RT 및 화학 요법의 치료 효능을 감소시키는 것으로 나타났습니다(23). 저산소 GM 세포는 유전적으로 불안정하고 MGMT 발현이 증가하여 알킬화 TMZ 화학 요법에 대한 저항성을 보입니다(24).

   비-GSC에서 MGMT 프로모터 메틸화는 TMZ 치료에 대한 반응을 예측하는 마커입니다(25,26). 그러나 MGMT 메틸화 분석의 해석은 복잡합니다. GM에서 MGMT 프로모터 메틸화 정도가 이질적이고 이질성 수준이 과소 평가되기 때문에 GM 생검 또는 조각난 GM 조직만 분석되기 때문입니다(27,28). 중요하게도 MGMT는 정상적인 뇌 내피 세포와 종양 침윤 세포를 포함한 면역 세포에서도 발현됩니다(29). 따라서 GM 생검에서 정상 조직 오염 정도에 따라 MGMT 메틸화 수준도 다를 수 있습니다.

   MGMT 발현의 종양 내 이질성은 현재 이용 가능한 진단을 사용하여 객관화할 수 없고 환자의 과소치료는 항상 예방되어야 하기 때문에 현재 'de novo' GM으로 진단된 대부분의 환자는 TMZ를 받습니다. MGMT 비메틸화 신경아교종 세포가 있는 GM에서는 TMZ의 이점이 거의 없는 것으로 보입니다.

   MGMT 프로모터 메틸화 상태(또는 MGMT 발현 수준)의 GM 내 및 간 이질성을 예측하는 진단 도구가 부족하기 때문에 새로 진단된 교모세포종에 대한 새로운 치료 프로토콜을 설계하는 것은 매우 복잡합니다. 또한 중요한 TMZ 반응 및 임상 결과 개선에 필요한 MGMT 발현 수준은 알려져 있지 않습니다. 따라서 대부분의 GM은 MGMT 메틸화 및 MGMT 비메틸화 종양 클론 모두에 의해 정의되기 때문에 TMZ를 비메틸화 신경교종 세포/신경교종 줄기 세포 및/또는 미세 환경을 표적으로 하는 약물과 결합하는 것이 필요할 수 있습니다.

2. Glioblastoma recurrence GM의 거시적 완전 절제가 가능하더라도 종양 세포는 절제 부위에 남아 있습니다. GM 세포는 전파 능력이 높은 것으로 나타났습니다. 침입한 종양 세포는 종양 덩어리의 주변에서 빠져나와 정상 뇌 실질에 광범위하게 침투합니다. 깊이 침윤된 종양 세포는 수술을 피할 가능성이 더 높으며 침윤이 종양 재발을 시작하고 추진하는 보다 탄력적인 세포 집단의 특성인지 여부는 알려지지 않았습니다. 침윤성 종양 세포를 줄이기 위해 수술 후 화학 요법과 방사선 치료를 한 후에도 거의 모든 GM이 재발하며 대부분 절제강 주위에서 발생합니다. 총절제술을 시행할 수 없는 경우 1차 방사선 요법 및 화학 요법도 클론 다양성을 감소시킬 수 있지만, 따라서 재발을 방지하기에는 불충분하다.

이는 여러 치료법에 내성이 있는 종양 세포가 총 절제술 후 종양 공동 주변의 뇌 실질 또는 종양 재증식을 담당하는 화학방사선 요법 후 남아있는 종양에서 지속되어 종양 재발을 극복하기 위한 중요한 표적이 됨을 의미합니다. GM의 게놈 분석은 재발성 종양에서 우세한 클론이 원발성 종양을 대표하는 클론과 원래 종양과 거의 유사하지 않은 새로운 클론으로 구성되어 있음을 보여주었습니다(3,30,31,32,33). 결과적으로 원발성 종양 분석을 기반으로 식별된 표적은 재발을 방지하기 위한 최상의 분자 표적을 식별하는 데 도움이 되지 않을 수 있습니다(5).

1차 GM 치료(방사선, TMZ) 실패 후, 재발은 중간엽(MES) 아형으로의 GSC의 표현형 이동(CD133의 손실; BMI1, SOX2 및 CD44의 증가)을 동반하는 것으로 보입니다(34-38). 이러한 세포는 주로 PN(proneural) 하위 유형(CD133+, CD15+)(39-41)인 원발성 종양 유래 GSC보다 더 공격적이고 침습적이며 혈관신생입니다. MES GSC는 또한 IL6, IL8, IL1B1C 및 CXCL2와 같은 inflammasome 유전자의 높은 발현을 보여 미세 환경과 상호 작용하고 재발 및 진행에 중요한 역할을 한다는 개념을 강화합니다(42,43). 면역 조절제를 사용하여 GM 특정 임상 시험이 개발되고 있습니다. MSH(mutS homologue) 돌연변이는 치료 전 GM이나 방사선 치료 후 GM에서 발견되지 않았지만 TMZ와 방사선 치료로 치료받은 재발성 GM 환자의 약 절반에서 발견되었기 때문에 TMZ 내성과 상관관계가 있는 것으로 나타났습니다. 이것은 MSH6 변경이 알킬화제 치료에 대한 내성과 관련이 있음을 강력하게 나타냅니다. 따라서 초기에 TMZ에 반응하는 GM 환자는 MMR 결함 과돌연변이 표현형을 획득할 수 있습니다(44-46). 손상되지 않은 불일치 복구 및 염기 절제 복구(BER)가 효과적인 TMZ 세포 독성에 기여한다는 것은 잘 알려져 있습니다. PARP 억제제를 단독으로 또는 TMZ와 조합하여 사용하는 BER의 약리학적 억제는 임상 시험에서 가능성을 보여주었습니다. 그러나 PARP 억제제에 대한 후천적 내성은 감소된 BER을 보상하기 위한 염기 절제 복구 및 동종 재조합 복구의 상향 조절을 통해 관찰됩니다(47,48).

결론적으로, 치료에 의해 유발된 나머지 종양 세포 및 GSC의 유전적 및 후성유전학적 변화와 재발이 발생하는 미세 환경/틈새에 대한 치료 표준의 영향을 이해하는 것이 새로운 치료법의 개발을 안내할 것입니다.

이 프로젝트에서 우리는 de novo GM과 종양 내 이질성을 모방한 환자 유래 신경아교종 줄기 세포 오가노이드(49)를 사용할 것입니다. 또한 이러한 환자 유래 오가노이드(PDO) 오가노이드는 획득된 테모졸로마이드 내성을 연구하는 데 사용될 것이며 따라서 새로운 표적 제제를 식별하는 데 사용될 수 있습니다.

MGMT 발현의 종양 세포 이질성과 TMZ 반응에 대한 관련성은 TMZ 하에서 클론적으로 확장되는 집단을 식별하기 위해 MGMT, GSC 마커 및 엑솜 시퀀싱(공통 드라이버 돌연변이에 대한)을 위한 단일 세포 프로테오믹스 및 IHC를 사용하여 이러한 오가노이드를 사용하여 해결될 것입니다. RT) 선택과 사라지는 것들.

PDO를 사용하여 탐색할 또 다른 흥미로운 기능은 TMZ 저항성을 획득한 후 이전에 순환 종양 DNA(ctDNA) 또는 엑소좀(RNA, 작은 비암호화 RNA, 단백질 및 DNA를 포함하는 분비된 소포)에 대한 상층액을 분석할 수 있는 가능성입니다. 약리학적 반응 및 예측 바이오마커의 식별로 이어질 수 있습니다. 이러한 바이오마커 '액체 생검'은 GM 환자의 혈액 또는 요추액에서 치료 반응을 측정하고 용량 조절(상승 또는 강화 또는 종료)을 가능하게 하는 데 유용할 수 있습니다.

PDO(재료 비용) 개발 자금이 지원됩니다(607061 PI M. Vooijs, MAASTRO 및 KWF 보조금 Alpe D'Huzes PI M.Vooijs, MAASTRO. 종양 조직을 얻는 것과 관련된 추가 비용은 없습니다.