Potilasperäiset glioomakantasoluorganoidit

Glioblastoomapotilaiden (GM) eloonjäämisajan mediaani on noin 15 kuukautta. GM:n standardihoito sisältää maksimaalisen kirurgisen resektion, jota seuraa sädehoito ja kemoterapia temotsolomidia (TMZ) käyttäen (1). Alkuperäisestä tuumorivasteesta riippumatta kasvaimen uusiutuminen on väistämätöntä, minkä jälkeen eloonjääminen laskee alle 6 kuukauteen. GM-räätälöidyt lähestymistavat, jotka kohdistetaan onkogeeneihin, jotka saattavat edistää suurimman osan primaaristen kasvainten kasvua, eivät ole tähän mennessä onnistuneet kliinisissä tutkimuksissa(2), mikä on luonut suuren tyydyttämättömän tarpeen, joka oikeuttaa uusia lähestymistapoja nykyisten hoito-ohjelmien sisäisen ja hankitun resistenssin voittamiseksi. Tämän tutkimuksen tavoitteena on luoda primaarisia potilasperäisiä organoidiviljelmiä GM:stä ja tutkia mekanismeja, jotka edistävät kasvaimen aggressiivista kasvua ja hoitoresistenssiä primaarisessa ja toistuvassa GM:ssä.

1. Inter- ja intratumoraalinen heterogeenisyys glioblastoomassa. Kasvaimeen räätälöityjä lähestymistapoja GM-soluissa haittaavat sekä mikroympäristön että GM-solujen genomimuutosten välinen ja kasvainten välinen heterogeenisyys. On osoitettu, että kasvaimet koostuvat useista klooneista, joissa on erilaisia ​​geneettisiä muutoksia (3-7). Klonaalinen evoluutiomalli olettaa, että kasvaimen muodostuminen alkaa alkuperäsolussa ja sitä seuraa useiden geneettisten ja epigeneettisten muutosten kertyminen, mikä johtaa kasvainsolujen eloonjäämiseen ja kasvuetuun (8). Varhain transformoituneiden solujen erilaiset geneettiset muutokset synnyttävät erilaisia ​​klooneja kasvaimen mikroympäristön selektiivisen paineen alaisena (3-7). Tärkeä mikroympäristön stressitekijä on kasvaimensisäinen hypoksia, joka on yleinen GM:ssä ja negatiivinen prognostinen ja ennustava tekijä, joka liittyy eloonjäämisen vähenemiseen (9, 10).

   Esiin tulleet todisteet viittaavat siihen, että kasvainsolujen alapopulaatio, jolla on normaalien kantasolujen ominaisuudet, niin kutsutut glioomakantasolut (GSC), luontaisessa ja hankitussa hoitoresistenssissä. GSC:llä on erityisiä ominaisuuksia, kuten korkea kasvainaloituskyky, rajoittamaton itseuudistumispotentiaali ja kyky monitehoiseen erilaistumiskykyyn, joka tuottaa monipuolisia jälkeläisiä (11). GSC:t on merkitty yleisillä kantasolumarkkereilla, mukaan lukien CD133+, SOX2, Olig1, ja niiden on osoitettu olevan perivaskulaarisella alueella sekä hypoksisilla alueilla. GSC:t laajennetaan hypoksian alla12 riippuen glykolyysistä (13,14).

   Yhdessä niiden vähäiseen lisääntymiseen, lisääntyneeseen DNA:n korjaukseen, korkeaan antioksidanttiaktiivisuuteen ja muun muassa tekevät GCS:stä vastustuskykyisemmän tavanomaisille hoidoille (säteily ja temotsolomidi) kuin ei-GSC:lle (15,16) {Jamal, 2012 #52}.

   Tämä tarkoittaa, että GSC:t ovat tärkeä tekijä GM:n uusiutumisessa kemosäteilyn jälkeen. Tällä hetkellä ei ole olemassa tehokkaita hoitoja gliooman kantasolujen poistamiseksi. Hypoksia-signaloinnin estäminen kasvaimissa (estää GSC-solujen itsensä uusiutumisen ja eloonjäämisen) (12, 17) ja NOTCH-kantasolureitin estäminen (teken GSC:istä herkkiä säteilylle (18) ja TMZ:lle (19-21)) näyttää lupaavalta, mutta näitä reittejä häiritsevät lääkkeet eivät ole vielä ylittäneet varhaisen vaiheen kliinisiä tutkimuksia(22).

   Hiljattain diagnosoidun glioblastooman nykyinen hoitostandardi on multimodaalista ja koostuu leikkauksesta, sädehoidosta ja TMZ:stä, alkyloivasta aineesta, joka modifioi DNA:n puriiniemäksiä (O6-guaniini; N7-guaniini ja N3-adeniini). TMZ:n lisääminen sädehoitoon on lisännyt GM-potilaiden kokonaiseloonjäämistä merkittävästi, mutta vain 14,6 kuukauteen(1). Intratumoraalisen hypoksian on osoitettu vähentävän RT:n ja kemoterapian terapeuttista tehoa (23). Hypoksiset GM-solut ovat geneettisesti epästabiileja ja osoittavat lisääntynyttä MGMT-ilmentymistä ja siten vastustuskykyä alkyloivalle TMZ-kemoterapialle (24).

   Muissa kuin GSC:issä MGMT-promoottorin metylaatio on ennustava markkeri vasteelle TMZ-hoitoon (25, 26). MGMT-metylaatiomäärityksen tulkinta on kuitenkin monimutkainen, koska MGMT-promoottorin metylaation laajuus GM:ssä on heterogeeninen ja heterogeenisyyden taso on aliarvioitu, koska vain GM-biopsiat tai fragmentoitunut GM-kudos analysoidaan (27,28). Tärkeää on, että MGMT ilmentyy myös normaaleissa aivojen endoteelisoluissa ja immuunisoluissa, mukaan lukien kasvaimeen tunkeutuvat solut (29). Siten riippuen normaalin kudoskontaminaation laajuudesta GM-biopsioissa, MGMT-metylaatiotaso voi myös vaihdella.

   Koska MGMT:n ilmentymisen intratumoraalista heterogeenisyyttä ei voida objektivoida käyttämällä tällä hetkellä saatavilla olevia diagnostisia menetelmiä ja koska potilaiden alihoito on aina estettävä, tällä hetkellä useimmat potilaat, joilla on diagnosoitu "de novo" GM, saavat TMZ:a. vaikka TMZ:stä näyttää olevan vain vähän hyötyä GM:issä, joissa on metyloitumattomia MGMT-glioomasoluja.

   Uusien hoitokäytäntöjen suunnittelu äskettäin diagnosoidulle glioblastoomalle on melko monimutkaista, koska diagnostisia työkaluja, jotka ennustavat MGMT-promoottorin metylaatiotilan (tai MGMT-ilmentymisen tason) GM:n välistä ja sisäistä heterogeenisyyttä, puuttuu. Lisäksi MGMT-ilmentymisen tasoa, jota tarvitaan merkittävään TMZ-vasteeseen ja kliinisen tuloksen parantamiseen, ei tunneta. Koska useimmat GM:t määrittävät sekä MGMT-metyloituneet että metyloimattomat MGMT-kasvainkloonit, TMZ:n yhdistäminen metyloitumattomiin glioomasoluihin/gliooman kantasoluihin ja/tai mikroympäristöön kohdistuvien lääkkeiden kanssa saattaa olla tarpeen.

2. Glioblastooman uusiutuminen Vaikka GM:n makroskooppisesti täydellinen resektio voidaan saavuttaa, kasvainsolut jäävät resektiokohtaan. On osoitettu, että GM-soluilla on suuri leviämiskyky. Tunkeutuvat kasvainsolut pakenevat kasvainmassan reuna-alueelta ja tunkeutuvat diffuusisesti normaaliin aivoparenkyymiin. Syvälle tunkeutuneet kasvainsolut pakenevat todennäköisemmin leikkauksesta, ja ei tiedetä, onko infiltraatio joustavamman solupopulaation ominaisuus, joka käynnistää ja ajaa kasvaimen uusiutumista. Jopa leikkauksen jälkeisen kemoterapian ja infiltratiivisten kasvainsolujen vähentämiseen tarkoitetun leikkauksen ulkopuolella tapahtuvan säteilyn jälkeen lähes kaikki GM uusiutuu, enimmäkseen resektioontelon ympärillä. Jos kokonaisresektiota ei voida suorittaa; primaarinen sädehoito ja kemoterapia pystyvät myös vähentämään kloonien monimuotoisuutta, mutta ne eivät siten riitä estämään uusiutumista.

Tämä tarkoittaa, että kasvainsolut, jotka ovat vastustuskykyisiä useille hoidoille, pysyvät aivoparenkyymassa kasvainontelon ympärillä kokonaisen kokonaisresektion jälkeen tai jäljelle jääneessä kasvaimessa kemosäteilyn jälkeen, jotka ovat vastuussa kasvaimen uudelleenpopulaatiosta, mikä tekee niistä kriittisen kohteen tuumorin uusiutumisen voittamiseksi. GM:n genominen analyysi on osoittanut, että toistuvien kasvainten hallitsevat kloonit koostuvat primaarista kasvainta edustavista klooneista sekä uusista klooneista, jotka muistuttavat vähän alkuperäistä kasvainta (3,30,31,32,33). Tästä syystä primaarisen kasvaimen analyysin perusteella tunnistetut kohteet eivät välttämättä ole informatiivisia tunnistamaan parhaat molekyylikohteet uusiutumisen estämiseksi (5).

Ensimmäisen linjan GM-hoidon (säteily, TMZ) epäonnistumisen jälkeen uusiutumiseen näyttää liittyvän GSC:iden fenotyyppinen siirtyminen mesenkymaaliseen (MES) alatyyppiin (CD133:n menetys; BMI1:n, SOX2:n ja CD44:n vahvistuminen) (34-38). Tällaiset solut ovat aggressiivisempia, invasiivisempia ja angiogeenisempiä kuin primaarisesta kasvaimesta peräisin olevat GSC:t, enimmäkseen proneuraalinen (PN) alatyyppi (CD133+, CD15+) (39-41). MES GSC osoittaa myös tulehdusgeenien, kuten IL6:n, IL8:n, IL1B1C:n ja CXCL2:n, korkeampaa ilmentymistä, mikä vahvistaa käsitystä siitä, että ne toimivat vuorovaikutuksessa mikroympäristön kanssa ja joilla on tärkeä rooli uusiutumisessa ja etenemisessä (42, 43). GM-spesifisiä kliinisiä tutkimuksia kehitetään immuunimodulaattoreiden avulla. On osoitettu, että MSH (mutS-homologi) -mutaatiot korreloivat TMZ-resistenssin kanssa, koska niitä ei löydy ennen hoitoa suoritetusta GM:stä eikä sädehoidon jälkeisestä GM:stä, mutta niitä havaittiin noin puolella toistuvista GM-potilaista, joita hoidettiin TMZ:llä ja sädehoidolla. Tämä osoittaa vahvasti, että MSH6-muutokset liittyvät resistenssiin alkylointiainehoidolle. Siten GM-potilaat, jotka alun perin reagoivat TMZ:hen, voivat saada MMR-virheenomaisen hypermutaattorifenotyypin (44-46). On hyvin todettu, että ehjä epäsopivuuskorjaus ja perusleikkauksen korjaus (BER) edistävät tehokasta TMZ:n sytotoksisuutta. BER:n farmakologinen esto käyttämällä PARP-estäjiä joko yksinään tai yhdessä TMZ:n kanssa on osoittanut lupaavaa kliinisissä tutkimuksissa. Hankittua resistenssiä PARP-inhibiittoreille havaitaan kuitenkin emäksen leikkauskorjauksen ja homologisen rekombinaatiokorjauksen säätelyn avulla kompensoimaan vähentynyttä BER:ää (47, 48).

Yhteenvetona voidaan todeta, että terapian aiheuttamien geneettisten ja epigeneettisten muutosten ymmärtäminen jäljellä olevissa kasvainsoluissa ja GSC:issä sekä myös hoidon standardin vaikutus mikroympäristöön / markkinarakoon, jossa uusiutuminen tapahtuu, ohjaa uusien hoitojen kehittämistä.

Tässä projektissa käytämme potilaasta peräisin olevia gliooman kantasoluorganoideja(49), jotka jäljittelevät de novo GM:ää ja sen intratumoraalista heterogeenisyyttä. Myös näitä potilasperäisiä organoideja (PDO) käytetään hankitun temotsolomidiresistenssin tutkimiseen ja siten niitä voidaan käyttää uusien kohdennettujen aineiden tunnistamiseen.

Kasvainsolujen heterogeenisyyttä MGMT:n ilmentymisessä ja sen merkitystä TMZ-vasteen kannalta tarkastellaan myös käyttämällä näitä organoideja, käyttämällä yksittäissoluproteomiikkaa ja IHC:tä MGMT:lle, GSC-markkereille ja eksomisekvensoinnille (yleisille kuljettajamutaatioille) niiden populaatioiden tunnistamiseksi, jotka laajenevat kloonisesti TMZ:n alla ( RT) -valinta ja ne, jotka katoavat.

Toinen mielenkiintoinen ominaisuus, jota tutkimme käyttämällä PDO:ta, on mahdollisuus analysoida supernatanteista kiertävän kasvain-DNA:n (ctDNA) tai eksosomien (eritettyjen vesikkeleiden, jotka sisältävät RNA:ta, pientä ei-koodaavaa RNA:ta, proteiineja sekä DNA:ta) varalta ennen hankittua TMZ-resistenssiä. saattaa johtaa farmakologisen vasteen ja ennustavien biomarkkerien tunnistamiseen. Tällaisista biomarkkereista "nestemäinen biopsia" voi tulla hyödyllistä mittaamaan hoitovastetta GM-potilaiden veressä tai lannenesteessä ja mahdollistaa annoksen muuttaminen (eskalaatio tai tehon vähentäminen tai lopettaminen).

SAN-tuotteiden (materiaalikustannusten) kehittäminen rahoitetaan (607061 PI M. Vooijs, MAASTRO ja KWF:n apuraha Alpe D'Huzes PI M. Vooijs, MAASTRO). Kasvainkudoksen hankkimiseen ei liity lisäkustannuksia.