Betegekből származó glioma őssejt organoidok

A glioblasztómában (GM) szenvedő betegek átlagos túlélése hozzávetőlegesen 15 hónap. A GM standard terápiája magában foglalja a maximális sebészi eltávolítást, majd a temozolomiddal (TMZ) végzett besugárzást és kemoterápiát (1). A kezdeti tumorválasztól függetlenül a daganat kiújulása elkerülhetetlen, ami után a túlélés 6 hónap alá csökken. A primer daganatok nagy részének növekedését előidéző ​​onkogéneket célzó, GM-re szabott megközelítések eddig sikertelenek voltak a klinikai vizsgálatok során (2), ami nagy kielégítetlen igényt teremtett, ami új megközelítéseket indokolt a jelenlegi kezelési ütemtervekkel szembeni belső és szerzett rezisztencia leküzdésére. Ennek a kutatásnak a célja a GM-ből származó elsődleges, páciensből származó organoid tenyészetek létrehozása olyan mechanizmusok tanulmányozása érdekében, amelyek hozzájárulnak az agresszív tumornövekedéshez és a kezelésrezisztenciához az elsődleges és a visszatérő GM-ben.

1. Inter- és intratumorális heterogenitás glioblasztómában. A GM tumorokra szabott megközelítését hátráltatja a mikrokörnyezet inter- és intratumorális heterogenitása, valamint a GM-sejtek genomiális változásai. Kimutatták, hogy a daganatok több klónból állnak, amelyek eltérő genetikai elváltozásokat hordoznak (3-7). A klonális evolúciós modell azt feltételezi, hogy a tumorképződés a származási sejtben indul be, és ezt követi többszörös genetikai és epigenetikai változások felhalmozódása, ami a tumorsejtek túléléséhez és növekedési előnyéhez vezet (8). A korai transzformált sejtek eltérő genetikai változásai különféle klónokat eredményeznek a tumor mikrokörnyezetének szelektív nyomása alatt (3-7). Fontos mikrokörnyezeti stresszor az intratumorális hypoxia, amely gyakori a GM-ben, és negatív prognosztikai és prediktív faktor, amely a túlélés csökkenésével jár (9, 10).

   Az újonnan megjelenő bizonyítékok a normál őssejtek, az úgynevezett glióma őssejtek (GSC) jellemzőivel rendelkező tumorsejtek szubpopulációjára utalnak a belső és szerzett kezelési rezisztenciában. A GSC-k specifikus tulajdonságokkal rendelkeznek, beleértve a nagy tumorindító képességet, a korlátlan önmegújulási potenciált és a multipotens differenciálódási képességet, amelyek változatos utódokat generálnak (11). A GSC-ket gyakori őssejtmarkerek jelölik, beleértve a CD133+-t, SOX2-t, Olig1-et, és kimutatták, hogy a perivascularis régióban, valamint a hipoxiás területeken találhatók. A GSC-k hipoxia alatt12 a glikolízistől függenek (13,14).

   Alacsony proliferációjukkal, fokozott DNS-javításukkal, magas antioxidáns aktivitásukkal és többek között ellenállóbbá teszik a GCS-t a hagyományos kezelésekkel (sugárzással és temozolomiddal), mint a nem GSC-vel szemben (15,16) {Jamal, 2012 #52}.

   Ez azt jelenti, hogy a GSC-k fontos mozgatórugói a kemoradiációt követően a GM-kiújulásnak. Jelenleg nincs hatékony kezelés a glióma őssejtek eltávolítására. Ígéretesnek tűnik a hipoxia jelátvitel blokkolása tumorokban (gátolja a GSC-sejtek önmegújulását és túlélését) (12,17) és a NOTCH őssejt-útvonal blokkolása (a GSC-ket érzékennyé teszi a sugárzásra (18) és a TMZ-re (19-21)). Az ezeket a folyamatokat befolyásoló gyógyszerek még nem lépték túl a korai fázisú klinikai vizsgálatokat (22).

   Az újonnan diagnosztizált glioblasztóma ellátásának jelenlegi standardja multimodális, és műtétből, sugárterápiából és TMZ-ből áll, amely egy alkilezőszer, amely módosítja a DNS purinbázisait (O6-guanin; N7-guanin és N3-adenin). A TMZ-nek a sugárkezeléshez való hozzáadása jelentősen, de csak 14,6 hónapig növelte a GM-betegek teljes túlélését (1). Kimutatták, hogy az intratumorális hipoxia csökkenti az RT és a kemoterápia terápiás hatékonyságát (23). A hipoxiás GM-sejtek genetikailag instabilak, és fokozott MGMT-expressziót mutatnak, és ezáltal ellenállnak az alkilező TMZ-kemoterápiával szemben (24).

   A nem GSC-kben az MGMT promoter metilációja a TMZ-kezelésre adott válasz prediktív markere (25, 26). Az MGMT metilációs vizsgálat értelmezése azonban bonyolult, mivel az MGMT promoter metilációjának mértéke a GM-ben heterogén, és a heterogenitás szintje alábecsült, mivel csak GM biopsziákat vagy fragmentált GM szöveteket elemeznek (27, 28). Fontos, hogy az MGMT a normál agyi endotélsejtekben és az immunsejtekben is expresszálódik, beleértve a tumor infiltráló sejteket (29). Így a GM biopsziák normál szöveti kontaminációjának mértékétől függően az MGMT metiláció szintje is eltérő lehet.

   Mivel az MGMT expressziójának intratumorális heterogenitása nem objektíválható a jelenleg rendelkezésre álló diagnosztikával, és mivel a betegek alulkezelését mindenkor meg kell akadályozni, jelenleg a „de novo” GM-vel diagnosztizált betegek többsége TMZ-t kap; bár úgy tűnik, hogy a TMZ-nek kevés előnye van az MGMT nem metilált gliómasejtekkel rendelkező GM-ekben.

   Az újonnan diagnosztizált glioblasztóma új kezelési protokolljainak kidolgozása meglehetősen bonyolult, mivel hiányoznak az MGMT promoter metilációs állapotának (vagy az MGMT expressziós szintjének) inter- és intra-GM heterogenitását előrejelző diagnosztikai eszközök. Ezenkívül nem ismert az MGMT expresszió szintje, amely a jelentős TMZ-válaszhoz és a klinikai kimenetel javításához szükséges. Így, mivel a legtöbb GM-et MGMT-metilált és MGMT-vel nem metilált tumorklónok határozzák meg, szükséges lehet a TMZ-t olyan gyógyszerekkel kombinálni, amelyek nem metilált gliómasejteket/glióma őssejteket és/vagy mikrokörnyezetet céloznak meg.

2. Glioblasztóma kiújulása Még ha egy GM makroszkopikusan teljes reszekciója is elérhető, a tumorsejtek a reszekció helyén maradnak. Kimutatták, hogy a GM-sejtek nagy terjesztési kapacitással rendelkeznek. A behatoló daganatsejtek a tumortömeg perifériáján kiszabadulnak, és diffúz módon beszivárognak a normál agyi parenchymába. A mélyen infiltrált daganatsejtek nagyobb valószínűséggel elkerülik a műtétet, és nem ismert, hogy az infiltráció egy rugalmasabb sejtpopuláció olyan tulajdonsága, amely elindítja és előidézi a tumor kiújulását. Még a posztoperatív kemoterápia és a műtéti területen kívüli besugárzás után is, hogy csökkentsék az infiltratív daganatsejteket, szinte minden GM kiújul, többnyire a reszekciós üreg környékén. Ha a bruttó teljes reszekció nem végezhető el; az elsődleges sugárterápia és a kemoterápia szintén képes csökkenteni a klonális diverzitást, de így nem elegendőek a kiújulás megelőzésére.

Ez azt jelenti, hogy a többszörös terápiával szemben rezisztens daganatsejtek megmaradnak a tumorüreg körüli agyi parenchymában a bruttó teljes reszekció után, vagy a fennmaradó daganatban a kemoradiáció után, amelyek felelősek a tumor újrapopulációjáért, így kritikus célponttá teszik őket a tumor kiújulásának leküzdésében. A GM genomiális analízise kimutatta, hogy a visszatérő daganatok domináns klónjai az elsődleges daganatot reprezentáló klónokból, valamint az eredeti daganathoz kevéssé hasonlító új klónokból állnak (3,30,31,32,33). Következésképpen az elsődleges daganat elemzése alapján azonosított célpontok nem feltétlenül informatívak a legjobb molekuláris célpontok azonosításához a kiújulás megelőzésére (5).

Az első vonalbeli GM-kezelés (sugárzás, TMZ) sikertelensége után úgy tűnik, hogy a kiújulás a GSC-k fenotípusos eltolódásával jár a mesenchymális (MES) altípus felé (CD133 elvesztése; BMI1, SOX2 és CD44 növekedése) (34-38). Az ilyen sejtek agresszívebbek, invazívabbak és angiogénebbek, mint a primer tumorból származó GSC-k, többnyire a proneurális (PN) altípus (CD133+, CD15+) (39-41). A MES GSC a gyulladásos gének, például az IL6, IL8, IL1B1C és CXCL2 magasabb expresszióját is mutatja, megerősítve azt az elképzelést, hogy kölcsönhatásba lépnek a mikrokörnyezettel, és fontos szerepet játszanak a kiújulásban és progresszióban (42, 43). GM-specifikus klinikai vizsgálatok folyamatban vannak immunmodulátorok felhasználásával. Kimutatták, hogy az MSH ​​(mutS homológ) mutációk korrelálnak a TMZ rezisztenciával, mivel sem a kezelés előtti GM-ben, sem a kezelés utáni GM-ben nem találhatók meg, de a TMZ-vel és sugárterápiával kezelt visszatérő GM-betegek körülbelül felében kimutatták. Ez határozottan azt jelzi, hogy az MSH6-változások az alkilezőszer-terápiával szembeni rezisztenciával állnak összefüggésben. Így azok a GM betegek, akik kezdetben reagálnak a TMZ-re, MMR-hiányos hipermutátor fenotípust szerezhetnek (44-46). Jól bebizonyosodott, hogy az intakt mismatch javítás és a báziskivágás javítása (BER) hozzájárul a hatékony TMZ citotoxicitáshoz. A BER farmakológiai gátlása PARP-gátlókkal önmagában vagy TMZ-vel kombinálva ígéretesnek bizonyult a klinikai vizsgálatok során. A PARP-inhibitorokkal szembeni szerzett rezisztencia azonban megfigyelhető a báziskivágás javításának és a homológ rekombináció javításának fokozása révén, hogy kompenzálja a csökkent BER-t (47, 48).

Összefoglalva, a fennmaradó tumorsejtek és GSC-k terápia által kiváltott genetikai és epigenetikai változásainak megértése, valamint a standard ellátás hatása a mikrokörnyezetre/résre, ahol a recidíva előfordul, az új kezelések kidolgozását fogja irányítani.

Ebben a projektben páciensből származó glióma őssejt organoidokat (49) fogunk használni, amelyek utánozzák a de novo GM-et és annak intratumorális heterogenitását. Ezeket a páciensből származó organoidokat (PDO) is használni fogják a szerzett temozolomid rezisztencia tanulmányozására, és így új célzott szerek azonosítására is felhasználhatók.

A tumorsejtek heterogenitását az MGMT-expresszióban és a TMZ-reakció szempontjából való relevanciáját szintén ezekkel az organoidokkal fogjuk kezelni, az egysejtű proteomika és az IHC segítségével az MGMT-hez, a GSC-markerekhez és az exome szekvenáláshoz (a gyakori driver-mutációkhoz), hogy azonosítsuk azokat a populációkat, amelyek klónosan terjeszkednek a TMZ alatt. RT) kiválasztás és azok, amelyek eltűnnek.

Egy másik érdekes tulajdonság, amelyet az OEM használatával megvizsgálunk, az a lehetőség, hogy a felülúszókban keringő tumor DNS-t (ctDNS) vagy exoszómákat (RNS-t, kisméretű, nem kódoló RNS-t, fehérjéket és DNS-t tartalmazó vezikulumok) elemezhessünk, mielőtt a TMZ-rezisztencia megszerzése után kialakulna. a farmakológiai válasz és a prediktív biomarkerek azonosításához vezethet. Az ilyen „folyékony biopszia” biomarkerek hasznosak lehetnek a GM-betegek vérében vagy ágyéki folyadékában a kezelésre adott válasz mérésére, és lehetővé teszik a dózis módosítását (eszkaláció vagy deintenzifikáció vagy befejezés).

Az OEM-ek (anyagköltségek) fejlesztését finanszírozzák (607061 PI M. Vooijs, MAASTRO és KWF támogatás Alpe D'Huzes PI M.Vooijs, MAASTRO). A daganatszövet beszerzése nem jár további költségekkel.