Органоиды стволовых клеток глиомы, полученные от пациентов

Медиана общей выживаемости пациентов с глиобластомой (ГМ) составляет примерно 15 месяцев. Стандартная терапия ГМ включает максимальную хирургическую резекцию с последующей лучевой и химиотерапией с использованием темозоломида (ТМЗ) (1). Независимо от исходного ответа опухоли рецидив опухоли неизбежен, после чего выживаемость снижается до менее 6 месяцев. Подходы, адаптированные к ГМ, нацеленные на онкогены, которые могут стимулировать рост основной массы первичных опухолей, до сих пор не увенчались успехом в клинических испытаниях (2), что создает большую неудовлетворенную потребность, требующую новых подходов для преодоления внутренней и приобретенной резистентности к текущим схемам лечения. Целью этого исследования является создание первичных культур органоидов, полученных от пациентов, из ГМ для изучения механизмов, которые способствуют агрессивному росту опухоли и резистентности к лечению при первичном и рецидивирующем ГМ.

1. Меж- и внутриопухолевая гетерогенность при глиобластоме. Подходам, адаптированным к опухолям для GM, препятствует меж- и внутриопухолевая гетерогенность как микроокружения, так и геномных изменений в GM-клетках. Было показано, что опухоли состоят из множества клонов, содержащих различные генетические изменения (3-7). Модель клональной эволюции постулирует, что образование опухоли инициируется в исходной клетке и сопровождается последующим накоплением множественных генетических и эпигенетических изменений, ведущих к выживанию и преимуществу роста опухолевых клеток (8). Дивергентные генетические изменения в ранних трансформированных клетках дают начало множеству клонов под селективным давлением микроокружения опухоли (3-7). Важным микросредовым стрессором является внутриопухолевая гипоксия, которая часто встречается при ГМ и является негативным прогностическим фактором, связанным со снижением выживаемости (9,10).

   Появляющиеся данные указывают на причастность субпопуляции опухолевых клеток с характеристиками нормальных стволовых клеток, так называемых стволовых клеток глиомы (GSC), к врожденной и приобретенной резистентности к лечению. GSC наделены специфическими свойствами, включая высокую способность инициировать опухоль, неограниченный потенциал самообновления и способность к мультипотентной дифференцировке, генерирующей разнообразное потомство (11). GSC отмечены общими маркерами стволовых клеток, включая CD133+, SOX2, Olig1, и было показано, что они находятся в периваскулярной области, а также в гипоксических областях. ГСК увеличиваются при гипоксии12 в зависимости от гликолиза (13,14).

   В сочетании с их низкой пролиферацией, повышенной репарацией ДНК, высокой антиоксидантной активностью и, среди прочего, ГКС более устойчивы к обычным методам лечения (радиация и темозоломид), чем к не-ГСК (15,16) {Jamal, 2012 #52}.

   Это означает, что ГСК являются важным фактором рецидива ГМ после химиолучевой терапии. В настоящее время не существует эффективных методов лечения стволовых клеток глиомы. Блокирование передачи сигналов гипоксии в опухолях (ингибирование самообновления и выживания клеток GSC) (12, 17) и блокирование пути стволовых клеток NOTCH (делая GSCs чувствительными к радиации (18) и TMZ (19-21)), кажутся многообещающими, но препараты, влияющие на эти пути, еще не прошли клинические испытания ранней фазы (22).

   Текущий стандарт лечения впервые диагностированной глиобластомы является мультимодальным и состоит из хирургического вмешательства, лучевой терапии и ТМЗ, алкилирующего агента, модифицирующего пуриновые основания ДНК (O6-гуанин, N7-гуанин и N3-аденин). Добавление TMZ к лучевой терапии значительно увеличило общую выживаемость пациентов с ГМ, но только до 14,6 месяцев (1). Было показано, что внутриопухолевая гипоксия снижает терапевтическую эффективность ЛТ и химиотерапии (23). Гипоксические клетки GM генетически нестабильны и демонстрируют повышенную экспрессию MGMT и, следовательно, устойчивость к химиотерапии алкилирующим TMZ (24).

   В не-GSC метилирование промотора MGMT является прогностическим маркером ответа на лечение TMZ (25, 26). Однако интерпретация анализа метилирования MGMT сложна, поскольку степень метилирования промотора MGMT в GM неоднородна, а уровень гетерогенности недооценен, поскольку анализируются только биопсии MGMT или фрагментированные ткани GM (27,28). Важно отметить, что MGMT также экспрессируется в нормальных эндотелиальных клетках головного мозга и в иммунных клетках, включая клетки, инфильтрирующие опухоль (29). Таким образом, в зависимости от степени контаминации нормальных тканей в биоптатах GM уровень метилирования MGMT также может различаться.

   Поскольку внутриопухолевая гетерогенность в экспрессии MGMT не может быть объективирована с помощью доступных в настоящее время диагностических средств, и поскольку необходимо всегда предотвращать недостаточное лечение пациентов, в настоящее время большинство пациентов с диагнозом «de novo» GM получают TMZ; хотя, по-видимому, TMZ малоэффективен для GM с неметилированными MGMT клетками глиомы.

   Разработка новых протоколов лечения впервые диагностированной глиобластомы довольно сложна, поскольку отсутствуют диагностические инструменты, предсказывающие меж- и внутри-ГМ-гетерогенность статуса метилирования промотора MGMT (или уровня экспрессии MGMT). Кроме того, уровень экспрессии MGMT, необходимый для значительного ответа TMZ и улучшения клинического исхода, неизвестен. Таким образом, поскольку большинство GM определяется как MGMT-метилированными, так и MGMT-неметилированными опухолевыми клонами, может быть необходимо комбинирование TMZ с препаратами, которые нацелены на неметилированные клетки глиомы/стволовые клетки глиомы и/или микроокружение.

2. Рецидив глиобластомы Даже если удается добиться макроскопически полной резекции СЖ, опухолевые клетки остаются в месте резекции. Было показано, что клетки GM обладают высокой способностью к диссеминации. Инвазивные опухолевые клетки выходят на периферию опухолевой массы и диффузно инфильтрируют нормальную паренхиму головного мозга. Глубоко инфильтрированные опухолевые клетки с большей вероятностью избегут хирургического вмешательства, и неизвестно, является ли инфильтрация свойством более устойчивой клеточной популяции, которая инициирует и стимулирует рецидив опухоли. Даже после послеоперационной химиотерапии и облучения вне поля хирургического вмешательства для уменьшения инфильтративных опухолевых клеток почти все ГМ рецидивируют, преимущественно вокруг резекционной полости. Если нельзя выполнить грубую тотальную резекцию; первичная лучевая терапия и химиотерапия также способны уменьшить клональное разнообразие, но их недостаточно для предотвращения рецидива.

Это означает, что опухолевые клетки, устойчивые к множественным методам лечения, сохраняются в паренхиме головного мозга вокруг полости опухоли после тотальной резекции или в оставшейся опухоли после химиолучевой терапии, которые ответственны за репопуляцию опухоли, что делает их важной мишенью для преодоления рецидива опухоли. Геномный анализ GM показал, что доминирующие клоны в рецидивирующих опухолях состоят из клонов, представляющих первичную опухоль, а также новых клонов, мало похожих на исходную опухоль (3,30,31,32,33). Следовательно, мишени, идентифицированные на основе анализа первичной опухоли, могут оказаться неинформативными для выявления наилучших молекулярных мишеней для предотвращения рецидива (5).

После неудачного лечения ГМ первой линии (облучение, TMZ) рецидив, по-видимому, сопровождается фенотипическим сдвигом GSCs к мезенхимальному (MES) подтипу (потеря CD133; увеличение BMI1, SOX2 и CD44) (34-38). Такие клетки более агрессивны, инвазивны и ангиогенны, чем GSC, происходящие из первичной опухоли, в основном пронейрального (PN) подтипа (CD133+, CD15+) (39-41). MES GSC также демонстрируют более высокую экспрессию генов воспаления, таких как IL6, IL8, IL1B1C и CXCL2, подтверждая представление о том, что они взаимодействуют с микросредой и играют важную роль в рецидивах и прогрессировании (42,43). Разрабатываются клинические испытания, специфичные для GM, с использованием иммуномодуляторов. Было показано, что мутации MSH (гомолог mutS) коррелируют с устойчивостью к TMZ, поскольку они не обнаруживаются ни при ГМ до лечения, ни при ГМ после лучевой терапии, но были обнаружены примерно у половины пациентов с рецидивирующим ГМ, получавших ТМЗ и лучевую терапию. Это убедительно указывает на то, что изменения MSH6 связаны с устойчивостью к терапии алкилирующими агентами. Таким образом, пациенты с ГМ, которые изначально реагируют на TMZ, могут приобрести гипермутаторный фенотип с дефектом MMR (44-46). Хорошо известно, что неповрежденная репарация несоответствия и эксцизионная репарация оснований (BER) способствуют эффективной цитотоксичности TMZ. Фармакологическое ингибирование BER с использованием ингибиторов PARP отдельно или в сочетании с TMZ показало себя многообещающим в клинических испытаниях. Тем не менее, приобретенная резистентность к ингибиторам PARP наблюдается за счет усиления эксцизионной репарации оснований и гомологичной рекомбинационной репарации для компенсации сниженного BER (47,48).

В заключение, понимание вызванных терапией генетических и эпигенетических изменений оставшихся опухолевых клеток и GSC, а также влияние стандарта лечения на микроокружение / нишу, в которой происходит рецидив, будет определять разработку новых методов лечения.

В этом проекте мы будем использовать органоиды стволовых клеток глиомы, полученные от пациентов (49), имитируя GM de novo и его внутриопухолевую гетерогенность. Кроме того, эти органоиды, полученные от пациентов (PDO), будут использоваться для изучения приобретенной устойчивости к темозоломиду и, таким образом, могут использоваться для идентификации новых целевых агентов.

Гетерогенность опухолевых клеток в экспрессии MGMT и ее значимость для ответа TMZ также будут решаться с использованием этих органоидов, с использованием протеомики отдельных клеток и IHC для MGMT, маркеров GSC и секвенирования экзома (для общих драйверных мутаций) для идентификации тех популяций, которые клонально размножаются под действием TMZ ( RT) выделения и те, что исчезают.

Еще одна интересная особенность, которую мы изучим с помощью PDO, — это возможность анализа супернатантов на наличие циркулирующей опухолевой ДНК (цтДНК) или экзосом (секретируемых везикул, содержащих РНК, малые некодирующие РНК, белки, а также ДНК) до и во время после приобретения резистентности к TMZ, которая может привести к идентификации фармакологического ответа и прогностических биомаркеров. Такие биомаркеры «жидкая биопсия» могут стать полезными для измерения реакции на лечение в крови или люмбальной жидкости у пациентов с ГМ и позволяют модифицировать дозу (эскалацию, деинтенсификацию или прекращение).

Разработка PDO (затраты на материалы) будет профинансирована (607061 PI M. Vooijs, MAASTRO и грант KWF Alpe D'Huzes PI M. Vooijs, MAASTRO. Никаких дополнительных затрат, связанных с получением опухолевой ткани.