Von Patienten stammende Gliom-Stammzellorganoide

Patienten mit Glioblastom (GM) haben ein mittleres Gesamtüberleben von etwa 15 Monaten. Die Standardtherapie für GM umfasst eine maximale chirurgische Resektion, gefolgt von Bestrahlung und Chemotherapie mit Temozolomid (TMZ) (1). Ungeachtet des anfänglichen Ansprechens des Tumors ist ein Wiederauftreten des Tumors unvermeidlich, wonach die Überlebenszeit auf weniger als 6 Monate sinkt. GM-maßgeschneiderte Ansätze, die auf Onkogene abzielen, die das Wachstum des Großteils von Primärtumoren antreiben könnten, waren bisher in klinischen Studien erfolglos(2), was einen großen ungedeckten Bedarf schafft, der neue Ansätze zur Überwindung intrinsischer und erworbener Resistenzen gegen aktuelle Behandlungspläne rechtfertigt. Das Ziel dieser Forschung ist es, primäre, von Patienten stammende Organoidkulturen aus GM zu etablieren, um Mechanismen zu untersuchen, die zu aggressivem Tumorwachstum und Behandlungsresistenz bei primärer und rezidivierender GM beitragen.

1. Inter- und intratumorale Heterogenität beim Glioblastom. Auf Tumore zugeschnittene Ansätze für GM werden durch die inter- und intratumorale Heterogenität sowohl der Mikroumgebung als auch der genomischen Veränderungen in GM-Zellen behindert. Es wurde gezeigt, dass Tumore aus mehreren Klonen bestehen, die unterschiedliche genetische Veränderungen beherbergen (3-7). Das klonale Evolutionsmodell geht davon aus, dass die Tumorbildung in einer Ursprungszelle initiiert wird und von der anschließenden Akkumulation mehrerer genetischer und epigenetischer Veränderungen gefolgt wird, was zu einem Überleben der Tumorzelle und einem Wachstumsvorteil führt (8). Divergente genetische Veränderungen in früh transformierten Zellen führen zu einer Vielzahl von Klonen unter dem selektiven Druck der Tumor-Mikroumgebung (3-7). Ein wichtiger mikroumgebungsbedingter Stressor ist die intratumorale Hypoxie, die bei GM häufig auftritt und ein negativer prognostischer und prädiktiver Faktor ist, der mit einem reduzierten Überleben verbunden ist (9,10).

   Neuere Erkenntnisse deuten darauf hin, dass eine Subpopulation von Tumorzellen mit Eigenschaften normaler Stammzellen, sogenannte Gliom-Stammzellen (GSC), mit intrinsischer und erworbener Behandlungsresistenz in Verbindung gebracht wird. GSC sind mit spezifischen Eigenschaften ausgestattet, darunter eine hohe tumorinitiierende Fähigkeit, ein unbegrenztes Selbsterneuerungspotential und die Fähigkeit zur multipotenten Differenzierung, wodurch eine vielfältige Nachkommenschaft entsteht(11). GSC sind durch gemeinsame Stammzellmarker gekennzeichnet, darunter CD133+, SOX2, Olig1, und es wurde gezeigt, dass sie sich sowohl in der perivaskulären Region als auch in hypoxischen Bereichen befinden. GSC werden unter Hypoxie12 in Abhängigkeit von der Glykolyse expandiert (13,14).

   Kombiniert mit ihrer geringen Proliferation, erhöhter DNA-Reparatur, hoher antioxidativer Aktivität und unter anderem machen sie GCS widerstandsfähiger gegenüber herkömmlichen Behandlungen (Bestrahlung und Temozolomid) als Nicht-GSC (15,16) {Jamal, 2012 #52}.

   Dies deutet darauf hin, dass GSCs eine wichtige Triebkraft für das Wiederauftreten von GM nach Radiochemotherapie darstellen. Derzeit gibt es keine wirksamen Behandlungen zur Eliminierung von Gliom-Stammzellen. Die Blockierung der Hypoxie-Signalgebung in Tumoren (Hemmung der Selbsterneuerung und des Überlebens von GSC-Zellen) (12,17) und die Blockierung des NOTCH-Stammzellwegs (wodurch GSCs empfindlich gegenüber Strahlung (18) und TMZ (19-21) werden) scheinen jedoch vielversprechend zu sein Medikamente, die in diese Signalwege eingreifen, sind noch nicht über klinische Studien in der Frühphase hinausgekommen(22).

   Der aktuelle Behandlungsstandard bei neu diagnostiziertem Glioblastom ist multimodal und besteht aus Operation, Strahlentherapie und TMZ, einem Alkylierungsmittel, das die Purinbasen der DNA modifiziert (O6-Guanin; N7-Guanin und N3-Adenin). Die Zugabe von TMZ zur Strahlentherapie hat das Gesamtüberleben von GM-Patienten signifikant verlängert, jedoch nur auf bis zu 14,6 Monate(1). Es wurde gezeigt, dass intratumorale Hypoxie die therapeutische Wirksamkeit von RT und Chemotherapie verringert(23). Hypoxische GM-Zellen sind genetisch instabil und zeigen eine erhöhte MGMT-Expression und dadurch eine Resistenz gegenüber alkylierender TMZ-Chemotherapie(24).

   Bei Nicht-GSCs ist die Methylierung des MGMT-Promotors ein prädiktiver Marker für das Ansprechen auf eine TMZ-Behandlung(25,26). Die Interpretation des MGMT-Methylierungsassays ist jedoch komplex, da das Ausmaß der MGMT-Promotormethylierung in GM heterogen ist und das Ausmaß der Heterogenität unterschätzt wird, da nur GM-Biopsien oder fragmentiertes GM-Gewebe analysiert werden(27,28). Wichtig ist, dass MGMT auch in den normalen Endothelzellen des Gehirns und in Immunzellen, einschließlich tumorinfiltrierender Zellen, exprimiert wird(29). Je nach Ausmaß der normalen Gewebekontamination in GM-Biopsien kann daher auch der Grad der MGMT-Methylierung unterschiedlich sein.

   Da die intratumorale Heterogenität in der MGMT-Expression mit derzeit verfügbaren Diagnostika nicht objektiviert werden kann und da eine Unterbehandlung der Patienten jederzeit verhindert werden sollte, erhalten derzeit die meisten Patienten, bei denen ´de novo´ GM diagnostiziert wurde, TMZ; obwohl es wenig Nutzen von TMZ bei GMs mit MGMT unmethylierten Gliomzellen zu geben scheint.

   Die Entwicklung neuer Behandlungsprotokolle für neu diagnostizierte Glioblastome ist ziemlich komplex, da diagnostische Werkzeuge zur Vorhersage der inter- und intra-GM-Heterogenität des MGMT-Promotor-Methylierungsstatus (oder des MGMT-Expressionsniveaus) fehlen. Darüber hinaus ist das Ausmaß der MGMT-Expression, das für eine signifikante TMZ-Reaktion und Verbesserung des klinischen Ergebnisses erforderlich ist, nicht bekannt. Da die meisten GMs sowohl durch MGMT-methylierte als auch durch MGMT-unmethylierte Tumorklone definiert sind, könnte die Kombination von TMZ mit Arzneimitteln, die auf nicht-methylierte Gliomzellen/Gliomstammzellen und/oder Mikroumgebung abzielen, erforderlich sein.

2. Glioblastom-Rezidiv Auch wenn eine makroskopisch vollständige Resektion eines GM erreicht werden kann, verbleiben Tumorzellen an der Resektionsstelle. Es hat sich gezeigt, dass gentechnisch veränderte Zellen eine hohe Verbreitungsfähigkeit haben. Eingedrungene Tumorzellen entweichen an der Peripherie der Tumormasse und infiltrieren diffus das normale Gehirnparenchym. Tief infiltrierte Tumorzellen entgehen mit größerer Wahrscheinlichkeit einer Operation, und es ist nicht bekannt, ob die Infiltration eine Eigenschaft einer widerstandsfähigeren Zellpopulation ist, die das Wiederauftreten des Tumors initiiert und vorantreibt. Auch nach postoperativer Chemotherapie und Bestrahlung außerhalb des Operationsfeldes zur Reduktion infiltrativer Tumorzellen treten fast alle GM wieder auf, meist um die Resektionshöhle herum. Wenn eine grobe Totalresektion nicht durchgeführt werden kann; Primäre Strahlentherapie und Chemotherapie sind ebenfalls in der Lage, die klonale Diversität zu reduzieren, reichen jedoch nicht aus, um ein Wiederauftreten zu verhindern.

Dies impliziert, dass Tumorzellen, die gegen mehrere Therapien resistent sind, im Gehirnparenchym um die Tumorhöhle herum nach einer groben Totalresektion oder im verbleibenden Tumor nach einer Radiochemotherapie verbleiben, die für die Tumorrepopulation verantwortlich sind, was sie zu einem kritischen Ziel für die Überwindung eines Tumorrezidivs macht. Genomanalysen von GM haben gezeigt, dass dominante Klone in rezidivierenden Tumoren aus Klonen zusammengesetzt sind, die für den Primärtumor repräsentativ sind, sowie aus neuen Klonen mit geringer Ähnlichkeit mit dem ursprünglichen Tumor (3,30,31,32,33). Folglich sind Ziele, die auf der Grundlage der Analyse des Primärtumors identifiziert wurden, möglicherweise nicht aussagekräftig, um die besten molekularen Ziele zur Verhinderung eines erneuten Auftretens zu identifizieren(5).

Nach Versagen der Erstlinien-GM-Behandlung (Bestrahlung, TMZ) scheint das Wiederauftreten von einer phänotypischen Verschiebung der GSCs zum mesenchymalen (MES) Subtyp begleitet zu sein (Verlust von CD133; Zunahme von BMI1, SOX2 und CD44)(34-38). Solche Zellen sind aggressiver, invasiver und angiogenetischer als GSCs, die aus Primärtumoren stammen, meistens der proneurale (PN) Subtyp (CD133+, CD15+)(39-41). MES-GSC zeigen auch eine höhere Expression der Inflammasom-Gene wie IL6, IL8, IL1B1C und CXCL2, was die Vorstellung verstärkt, dass eine Wechselwirkung mit der Mikroumgebung besteht und eine wichtige Rolle bei Rezidiv und Progression spielt(42,43). Es werden GM-spezifische klinische Studien mit Immunmodulatoren entwickelt. Es wurde gezeigt, dass MSH-Mutationen (mutS-Homolog) mit TMZ-Resistenz korrelieren, da sie weder bei GM vor der Behandlung noch bei GM nach der Strahlentherapie gefunden werden, aber bei etwa der Hälfte der Patienten mit rezidivierendem GM, die mit TMZ und Strahlentherapie behandelt wurden, nachgewiesen wurden. Dies deutet stark darauf hin, dass MSH6-Veränderungen mit einer Resistenz gegen eine Therapie mit Alkylierungsmitteln assoziiert sind. Daher können GM-Patienten, die anfänglich auf TMZ ansprechen, einen MMR-defekten Hypermutator-Phänotyp erwerben (44-46). Es ist allgemein bekannt, dass eine intakte Mismatch-Reparatur und Basenexzisionsreparatur (BER) zu einer effektiven TMZ-Zytotoxizität beitragen. Die pharmakologische Hemmung von BER mit PARP-Inhibitoren entweder allein oder in Kombination mit TMZ hat sich in klinischen Studien als vielversprechend erwiesen. Jedoch wird eine erworbene Resistenz gegen PARP-Inhibitoren durch eine Hochregulierung der Reparatur der Basenexzision und der Reparatur der homologen Rekombination beobachtet, um die verringerte BER zu kompensieren (47, 48).

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das Verständnis der therapieinduzierten genetischen und epigenetischen Veränderungen der verbleibenden Tumorzellen und GSCs sowie der Auswirkungen der Standardbehandlung auf die Mikroumgebung / Nische, in der ein Rezidiv auftritt, die Entwicklung neuer Behandlungen leiten wird.

In diesem Projekt werden wir von Patienten stammende Gliom-Stammzellen-Organoide(49) verwenden, die de novo GM und seine intratumorale Heterogenität nachahmen. Auch diese von Patienten stammenden Organoide (PDO) werden zur Untersuchung erworbener Temozolomid-Resistenzen verwendet und können somit zur Identifizierung neuer zielgerichteter Wirkstoffe verwendet werden.

Die Heterogenität der Tumorzellen in der MGMT-Expression und ihre Relevanz für die TMZ-Antwort werden ebenfalls unter Verwendung dieser Organoide angegangen, wobei Einzelzell-Proteomik und IHC für MGMT, GSC-Marker und Exom-Sequenzierung (für häufige Treibermutationen) verwendet werden, um die Populationen zu identifizieren, die sich unter TMZ klonal ausdehnen ( RT) Auswahl und solche, die verschwinden.

Ein weiteres interessantes Merkmal, das wir mit PDO untersuchen werden, ist die Möglichkeit, die Überstände auf zirkulierende Tumor-DNA (ctDNA) oder Exosomen (abgesonderte Vesikel, die RNA, kleine nicht-kodierende RNA, Proteine ​​​​sowie DNA enthalten) vor während nach erworbener TMZ-Resistenz zu analysieren könnte zur Identifizierung von pharmakologischen Reaktionen und prädiktiven Biomarkern führen. Eine solche Biomarker-„Flüssigbiopsie“ kann nützlich werden, um das Ansprechen auf die Behandlung im Blut oder in der Lendenflüssigkeit von GM-Patienten zu messen und eine Dosisanpassung (Eskalation oder De-Intensivierung oder Beendigung) zu ermöglichen.

Die Entwicklung der PDOs (Materialkosten) wird gefördert (607061 PI M. Vooijs, MAASTRO und KWF-Zuschuss Alpe D'Huzes PI M. Vooijs, MAASTRO. Durch die Gewinnung des Tumorgewebes entstehen keine zusätzlichen Kosten.